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申请/专利权人：北京工业大学

摘要：一种利用SYBRGREENI单染色技术检测污水处理活性污泥中聚糖菌的方法，属于污水生物处理技术领域。本发明根据聚糖菌的物理性质联合SYBRGREENI单染色技术，检测其在污水处理系统中的含量。通过流式细胞仪对全菌形态特点进行检测，根据细菌体积大小与胞内颗粒复杂情况，分析聚糖菌占全菌的百分比，进而对聚糖菌做相对定量。本发明提供了一种经济、简便、可靠的污水处理系统活性污泥中聚糖菌的定量方法，为实际污水处理厂调控生物除磷条件提供了理论依据。

主权项：1.一种利用SYBRGREENI单染色技术检测污水处理活性污泥中聚糖菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取处理生活污水反应器中的泥于离心管中，在10000rmin离心3min，弃掉上清液，并往离心管上加入与泥相同体积PBS缓冲液，3倍泥体积质量百分比浓度为4%的多聚甲醛溶液，4℃固定3h；（2）离心弃掉上清液，往离心管加入与泥相同体积PBS缓冲液，超声破碎；（3）离心弃掉上清液，依次往离心管加入体积百分数为50%，80%，99%乙醇溶液，每次脱水3分钟共9分钟，每次加入乙醇溶液量为2倍泥体积，晾干；（4）往离心管中加入3倍泥体积的PBS缓冲液，然后依次在30μm与10μm滤膜过滤；（5）往过滤后的样品加入SYBRGreenI染料，染色半小时；（6）对染色后的样品稀释500倍后，开启流式细胞仪，对样品进行检测；（7）在流式细胞仪第一通道上设置FL1=700，收集50000个颗粒，对SYBRGreenI显示阳性的区域进行圈门，对流式表示颗粒体积与复杂情况的图中圈出最靠右单独的区域，得到聚糖菌占全菌的百分占比。

全文数据：一种利用SYBRGREENI单染色技术检测污水处理活性污泥中聚糖菌的方法技术领域本发明涉及一种利用SYBRGREENI单染色技术检测污水处理活性污泥中聚糖菌的方法，属于污水生物处理技术领域，用于对污水生物处理系统中聚糖菌的定量分析。背景技术水体富营养化已经成为我国可持续发展所面临的重要环境问题之一，而氮、磷是产生水体富营养化的主要因素。目前较经济有效的除磷方法便是基于聚磷菌过量吸磷作用的强化生物除磷方法。在EBPR系统中除聚磷菌外，还有另外一类微生物—聚糖菌，也可在厌氧环境中吸收碳源并合成聚羟基链烷酸酯储藏在细胞内，但不释放磷，在好氧条件下分解PHAs合成糖原而不聚积磷，对于除磷没有贡献。这2种微生物因在厌氧条件下利用不同的胞内储藏能源而被加以区别，聚磷菌吸收碳源合成PHAs的能量主要来自胞内聚磷的水解，而聚糖菌依靠水解胞内的碳水化合物获得能量，该能量供聚糖菌在厌氧环境下生存并可用来吸收细胞外的碳源在细胞内生物合成PHAs。在实际应用过程中，EBPR工艺经常出现除磷效果不稳定的现象。近年来的研究表明，导致上述现象的主要原因之一就是聚糖菌与聚磷菌在厌氧环境下形成对底物的竞争关系，由于强化生物除磷系统中厌氧阶段碳源有限，当GAOs吸收的碳源增多时，可供PAOs利用的碳源数量就减少，整个强化生物除磷系统除磷效率受到影响。分子生物学的发展，为污水处理系统中微生物系统发育及其多样性，提供了新的见解。流式细胞仪是一种将待测颗粒维持在液流状态，然后依次单个通过激发光源。待测颗粒由于自身的荧光特性或通过与染料物质相结合，在激光作用下显示出荧光特性和散射光特性，从而与非生物颗粒区分。为流式细胞仪的基本工作原理及典型的实验结果。散射光主要提供细胞的物理特性，荧光特性提供生物特异性质。流式细胞仪技术的关键在于维持单个细胞依次通过激发光源，能分析出某个群落中单个细胞的性质，对群落的分析更加具体和个性化。待检测的细胞可以依靠自身的荧光特性进行测定，也可以通过外加荧光物的特异性与细胞结合达到检测的目的。实验结果以单参数的柱状图或双参数的散点图来表示。流式细胞仪可快速分析水样的细菌总数、细胞尺寸大小及表征细胞的生理特性。其大多用在医学领域，对鼠类、人体细胞研究，也用在海洋领域，对浮游微生物定量分析；在污水处理领域，对单种细菌种类分析较少。本发明利用细菌的体积及胞内颗粒复杂情况不同，利用SYBRGREENI单染色联合流式细胞仪对污水处理系统中聚糖菌的定量，本发明在技术上不同于现有技术，主要体现在以下方面：1现有技术对聚糖菌定量的方法，主要是荧光原位杂交技术；该方法利用涂片、探针杂交，在荧光显微镜下选取不同视野，利用图像处理软件对聚糖菌进行定量；该方法前期处理时间过长，步骤复杂；探针杂交情况、涂片效果、视野的选取及定量过程受操作者的个人经验和主观判断影响较大，可能会出现实测值与真实值相差较大的情况。而且由于探针染料的淬灭性，实验过程需要在避光情况下进行，操作不方便。而本发明不需涂片，探针杂交等费时间的过程，省时成本低；其样品用流式细胞仪检测，不存在视野选取所产生的误差问题；实验仅用了SYBRGreenI染料，该染料荧光性强，无淬灭性，因此实验可以不在避光下进行。2实时定量PCR方法也是目前比较流行对细菌定量的方法，该方法是对DNA水平的定量。前期需要提取DNA，利用特定引物及其荧光染料对特定细菌进行定量；样品的预处理，拷贝数的选择，质粒质量的好坏对实验结果影响很大。而且现在还不存在引物能对全部聚糖菌进行定量。该方法针对的是单个细菌，不需要提取DNA，不需要引物来引出DNA的扩增；仅用单个染色剂就能对全部聚糖菌进行定量。3传统的方法主要是利用双染色剂检测细菌，即利用FITC染全菌，CY5或CY3染目标细菌，实验操作较为复杂；探针一般都有很强的淬灭性，放置一段时间会荧光损失，因此荧光探针使用过程和保存过程都需要严格避光；而且探针杂交的过程中需要营造良好的杂交环境，才能更好的进入细菌内进行DNA双链的结合。本发明用SYBRGREENI单染色技术来检测聚糖菌，该染料是小分子染色剂，荧光性强，且不具有淬灭性，易进入细菌，使用操作简单，不用严格避光。故本发明取污水处理系统中活性污泥微生物，采用SYBRGREENI单染色联合流式细胞仪技术，利用细菌体积及胞内颗粒复杂情况不同分析微生物群落中聚糖菌的百分含量，未见相关研究报道。发明内容本发明目的是提供了一种经济、简便、可靠的污水处理系统活性污泥中聚糖菌的定量方法。采用SYBRGREENI染料对全菌染色，标记全菌DNA。标记后的菌液稀释后，进入流式细胞仪检测细胞数目，对被检测的主要的菌群进行FL1通道圈门。利用聚糖菌体积及其胞内复杂程度较大的特点，圈出FSC-SSC图中聚糖菌，用于分析聚糖菌群占全菌的比例，进而得出聚糖菌的含量。可用于快速监控污水处理系统中聚糖菌的丰度和百分含量的动态变化，指导污水处理厂运行调控，具有很好的应用前景。本发明的技术方案：1取处理生活污水反应器中的泥于离心管中，在10000rmin离心3min，弃掉上清液，并往离心管上加入与泥相同体积PBS缓冲液，3倍泥体积质量百分比浓度为4％多聚甲醛溶液，4℃固定3h；2离心弃掉上清液，往离心管加入与泥相同体积PBS缓冲液，利用超声破碎仪，超声功率80W，超声4min30s；3离心弃掉上清液，依次往离心管加入体积百分数为50％，80％，99％乙醇溶液，每次脱水3分钟共9分钟，每次加入乙醇溶液量为2倍泥体积，晾干；4往离心管中加入3倍泥体积的PBS缓冲液，然后依次在30μm与10μm滤膜过滤；5往过滤后的样品加入SYBRGreenI染料，染色半小时；6对染色后的样品稀释500倍后，开启流式细胞仪，对样品进行检测；7在流式细胞仪一通道上设置FL1＝700，收集50000个颗粒，对SYBRGreenI显示阳性的区域进行圈门，对流式表示颗粒体积与复杂情况图中圈出显示体积和颗粒情况较大的区域，得到聚糖菌的百分占比。本发明的有益效果：磷是维持生物体正常生理活动重要元素，其过度排放会导致水体富营养化，防止磷元素进入水体，是解决富营养化问题的根本手段之一。强化生物除磷工艺通过富集聚磷菌进行除磷，是一种经济高效的除磷方法，但EBPR系统的除磷效果又经常由于聚糖菌的过度繁殖而难以稳定。本发明提供经济、简便、省时的检测污水处理系统中聚糖菌的方法，可快速检测污水中聚糖菌的丰度，及时有效的调控使聚糖菌过度繁殖的条件，抑制聚糖菌的生长，避免生物除磷系统的崩溃。本发明利用细菌体积与胞内颗粒复杂程度的不同来区分聚糖菌与其他细菌，不需探针杂交，不需提取DNA，仅用SYBRGreenI染料染色来提供样品检测时的阈值；样品由流式细胞仪检测，实验操作简单，省时，经济，结果可靠，具有很好的推广前景。本发明的创新点：1本发明针对污水处理系统复杂的微生物环境，采用SYBRGreenI强荧光染料单染细菌，与聚糖菌形态体积的复杂性来结合，在不使用特定探针的情况下，检测环境样本中的聚糖菌，操作简单，且不需在避光下进行，通用性好，检测成本低。2本发明利用了流式细胞仪检测样品的敏捷性与准确性，采用DNA染料标记排除杂质对实验的影响，利用前散射光与侧散射光的检测特性，区分聚糖菌与其他细菌不同；实验结果可靠、稳定性好，减少了人为操作所带来的误差。3本发明根据对细菌的研究，严格控制了超声时间及超声功率，在能保证细菌的完整性的情况下，更好的分散细菌，减少细菌由于超声功率过强与超声时间过长所产生DNA碎片及其他杂质，使实验结果更加可靠。附图说明图1聚糖菌单染色圈门点图。图1a是经SYBRGreenI染色后的全菌荧光点图；图1b是经SYBRGreenI染色后的全菌位置点图；图1c是SYBRGreenI显阳性全菌位置点图，聚糖菌的占比图；图1a为样本FL1-SSC图，表示DNA含量与胞内颗粒复杂程度的关系，圈出颗粒集中的区域P1，表示的细菌的实际数与未染进细菌的染料数目。图1b为P1区域FSC-SSC图，表示收集的颗粒体积大小与胞内复杂程度的图，圈出图中未在边缘的颗粒的区域P2，P2表示样本的所有细菌，边缘颗粒表示未进细菌的SYBRGreenI染料；图1c表示P2区域所有的细菌点根据体积大小与胞内颗粒复杂程度在系统中的位置图，根据聚糖菌与其他污水处理微生物体积大的特点，圈出最靠右与大部分颗粒分开的区域P3，即为聚糖菌的数目。图2聚糖菌双染色对比图。图2a是经SYBRGreenI与探针双染色后的第四通道与SSC荧光点图；图2b是双染色检测出的聚糖菌的FSC-SSC图；图2c是双染色检测出聚糖菌在全菌中的位置；图2a为双染色情况下，FL4-FSC图，表示用CY5染色的样本与细菌体积大小的关系，圈出用聚糖菌探针染色的目标区域R1；对圈出来的R1区域转化成FSC--SSC图，即为图2b，再将R1区域在全菌位置中显示，即为图2c。具体实施方式1污泥微生物固定a.取泥样300μL于2ml离心管中，在10000rmin转速下离心3分钟，弃掉上清液，并加入300μL的PBS缓冲液；b.在离心管中加入1.2ml的质量百分比浓度为4％多聚甲醛在4℃下固定3h；2固定后清洗及稀释a.从4℃拿出离心管，在14000rmin离心2min30s；b.去除上清液；c.往管中加入1.2ml的1×PBS磷酸缓冲液，离心去除上清液；重复该步骤两次；d.往管中加入300μL的1×PBS磷酸缓冲液；3超声分散及乙醇脱水a利用超声破碎仪，超声功率80W，每超声30s后停5s，共超声4min30s；b将超声样本分装成两份；C分装好的样本，依次往离心管加入体积百分数为50％，80％，99％乙醇溶液，每次脱水3分钟共9分钟，每次加乙醇600μL，晾干即可；4染料染色及过滤a往离心管中加入990μl1×PBS磷酸缓冲液，超声40s，让样品均匀混合；b往超声后的样品加入10μl10000×SYBRGreenI染料，摇匀，常温染色30min；c染色后的样品先由30μm滤膜过滤，然后再用10μm滤膜过滤；5上机检测a设置第一通道阈值为700，开始进样，收集50000个颗粒；图1a为样本FL1-SSC图，表示DNA含量与胞内颗粒复杂程度的关系，圈出颗粒集中的区域P1，表示的细菌的实际数与未染进细菌的染料数目。图1b为P1区域FSC-SSC图，表示收集的颗粒体积大小与胞内复杂程度的图，圈出图中未在边缘的颗粒的区域P2，P2表示样本的所有细菌，边缘颗粒表示未进细菌的SYBRGreenI染料；图1c表示P2区域所有的细菌点根据体积大小与胞内颗粒复杂程度在系统中的位置图，根据聚糖菌与其他污水处理微生物体积大的特点，圈出最靠右与大部分颗粒分开的区域P3，即为聚糖菌的数目。6用FISH-Flow对照实验结果图2a为双染色情况下，FL4-FSC图，表示用CY5染色的样本与细菌体积大小的关系，圈出用聚糖菌探针染色的目标区域R1；对圈出来的R1区域转化成FSC--SSC图，即为图2b，再将R1区域在全菌位置中显示，即为图2c。由图2c和图1c比较，聚糖菌所在两图位置一致。FISH-Flow具体实施方式：1.污泥中微生物菌群的固定及杂交染色1.1样品的固定a.取待测活性污泥样品100μL于1.5ml离心管中；b.在离心管中加入300μl的固定液；c.在4℃下固定样品2h；1.2固定后稀释a.固定结束后拿出离心管，14000rmin下离心2-3min，去除上清液；b.加入等量的1×PBS两次，用来清洗残留的固定液；1.3杂交与洗脱探针a.乙醇脱水：在体积分数为50％、80％、99％的乙醇中各脱水3min；b.准备杂交缓冲液和杂交清洗液；按下表配制杂交缓冲液和杂交清洗液。配制杂交缓冲液加药顺序：向2mL离心管中依次加入甲酰胺、NaCl、TrisHCl、SDS、无菌双蒸水，加药完毕盖盖摇匀。配制杂交清洗液c.杂交按杂交缓冲液：探针GAOmix＝8:1体积比将二者混合，混合溶液体积为300μl，在涡流混匀仪上混匀，离心，然后加到100μl样品中。避光条件下超声分散1min；放入46℃恒温杂交箱中杂交2h。d.清洗稀释过滤杂交后的样本离心去掉上清液，加入杂交清洗液清洗，离心，去掉上清液。加入1mlPBS，超声一分钟，经10μm滤膜过滤。2流式上机检测分析流式一通道荧光阈值设为FL1＝800，收集30000个颗粒；圈门Cy5标记的显阳性的聚糖菌细胞群，得出聚糖菌在全菌中的数量百分比。

权利要求：1.一种利用SYBRGREENI单染色技术检测污水处理活性污泥中聚糖菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：1取处理生活污水反应器中的泥于离心管中，在10000rmin离心3min，弃掉上清液，并往离心管上加入与泥相同体积PBS缓冲液，3倍泥体积质量百分比浓度为4％的多聚甲醛溶液，4℃固定3h；2离心弃掉上清液，往离心管加入与泥相同体积PBS缓冲液，超声破碎；3离心弃掉上清液，依次往离心管加入体积百分数为50％，80％，99％乙醇溶液，每次脱水3分钟共9分钟，每次加入乙醇溶液量为2倍泥体积，晾干；4往离心管中加入3倍泥体积的PBS缓冲液，然后依次在30μm与10μm滤膜过滤；5往过滤后的样品加入SYBRGreenI染料，染色半小时；6对染色后的样品稀释500倍后，开启流式细胞仪，对样品进行检测；7在流式细胞仪第一通道上设置FL1＝700，收集50000个颗粒，对SYBRGreenI显示阳性的区域进行圈门，对流式表示颗粒体积与复杂情况的图中圈出靠右单独的区域，得到聚糖菌占全菌的百分占比。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，超声破碎利用超声破碎仪，超声功率为80W，每超声30s后停5s，共超声4min30s。

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