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申请/专利权人：四川大学华西医院

摘要：本发明提供了一种给药系统，所述给药系统中载有光敏剂焦脱镁叶绿酸a，所述给药系统的结构如式I所示。本发明还提供了一种光动力‑化疗联用给药系统，所述光动力‑化疗联用给药系统是以上述给药系统与阿霉素盐酸盐为原料制得的。本发明构建的光动力‑化疗联用的给药系统不仅进一步延长了药物的血液循环时间和滞留时间，提高了其在肿瘤部位的富集强度，还达到了肿瘤光动力和化疗协同增效的目的，同时也实现了对肿瘤治疗过程的实时监测和评估，最终在体内抗肿瘤实验中取得了显著的抑瘤效果。因此，本发明以PEG‑Peptide线性‑树状共聚物为载体材料构建的光动力‑化疗联用的给药系统是一种高安全且能有效地抑制恶性肿瘤的治疗手段，在制备抗肿瘤药物上具有很好的前景。

主权项：1.一种给药系统，所述给药系统中载有光敏剂焦脱镁叶绿酸a，其特征在于：所述给药系统的结构如式I所示： 其中，R1～R4各自独立地选自氨基保护基或且R1～R4中有1～4个n为聚合度，n为44。

全文数据：一种PEG-Peptide光动力-化疗联用给药系统及其制备方法和用途技术领域本发明属于高分子材料领域，具体涉及一种PEG-Peptide光动力-化疗联用给药系统及其制备方法和用途。背景技术光动力治疗PhotodynamicTherapy，PDT是利用肿瘤细胞选择性吸收光敏剂，然后利用特定波长的非热激光照射病变部位，使肿瘤组织中的光敏剂发生剧烈的光化学反应，产生具有细胞毒性的活性氧物种reactiveoxygenspecies，ROS，从而选择性地消灭肿瘤细胞。PDT的抗肿瘤效应的机制主要分为三类：1产生单线态氧直接杀伤肿瘤细胞，诱导细胞凋亡或坏死；2破坏肿瘤滋养血管，导致肿瘤缺血缺氧；3增加炎症及免疫介质的释放，甚至启动特异性免疫机制识别并破坏远处转移病灶。目前，国内外已经有多个光敏剂上市，光动力疗法以微创、副作用小等优点在肿瘤治疗方面取得了较好的疗效，但目前临床上常用光敏剂存在水溶性差、细胞摄取量低、代谢缓慢、缺乏靶向性和滞后的光毒性等问题。因此部分光敏剂可作为光动力学治疗用药。比如，光敏剂焦脱镁叶绿酸aPyropheophorbidea,Ppa。光动力疗法拥有化疗等传统治疗手段不具备的优点，但仍存在肿瘤靶向性不足、治疗深度较浅等问题，同时由于恶性肿瘤自身的复杂性和发生发展的多因素性，单一治疗手段还不足以达到理想的治疗效果。因此，光动力疗法和化疗的合理联合应用引起了广泛的关注。中国专利CN105749280A公开了一种协同化疗与光动力治疗的肿瘤靶向纳米给药系统。该给药系统由羧甲基壳聚糖、叶酸、光敏剂二氢卟吩e6和阿霉素构成，先将二氢卟吩e6和叶酸通过酰胺键偶联到羧甲基壳聚糖链段上，再经离子交联法得到负载阿霉素的聚合物纳米粒，形成靶向抗肿瘤纳米给药体系。但是，该给药系统的制备过程复杂，靶向分子叶酸的偶联增加了制备的工艺；并且其肿瘤抑制效果还远远不能满足需求。近年来研究发现，化疗与光动力治疗联用有望取得更显著的肿瘤治疗效果，但是，由于药物药理作用和机制的复杂性，双药联用也有可能引起拮抗作用，反而减弱治疗效果。因此，提供一种结构简单、制备方便，并且对肿瘤的治疗效果显著的光动力治疗与化疗联用给药系统具有广阔的应用前景。发明内容本发明的目的在于提供一种结构简单、制备方便，并且对肿瘤的治疗效果显著的光动力治疗与化疗联用给药系统。本发明提供了一种给药系统，所述给药系统中载有光敏剂焦脱镁叶绿酸a所述给药系统的结构如式I所示：其中，R1～R4各自独立地选自氨基保护基或且R1～R4中有1～4个n为聚合度，n为44。进一步地，所述氨基保护基选自Boc基团、Cbz基团、Fmoc基团、Alloc基团、Pht基团、PMB基团、Bn基团，优选为Boc基团。进一步地，所述给药系统中，焦脱镁叶绿酸a的载药量为5.00％～15.00％，优选为14.33％。载药量表示被测体系中，药物的质量给药系统总质量×100％。本发明给药系统中，焦脱镁叶绿酸a的载药量＝焦脱镁叶绿酸a的质量给药系统总质量×100％。本发明还提供了一种光动力-化疗联用给药系统，所述光动力-化疗联用给药系统是以权利要求1-3任一项所述给药系统与阿霉素盐酸盐为原料制得的。进一步地，所述光动力-化疗联用给药系统中，阿霉素的载药量为3.00～8.00％，优选为6.92％。阿霉素的载药量＝阿霉素的质量光动力-化疗联用给药系统总质量×100％。本发明还提供了一种制备上述给药系统的方法，所述方法包括：1化合物3先与脱保护剂反应，脱去BuOt基团，然后与Boc-cystaminehydrochloride发生缩合反应，得到化合物7；2化合物7先与脱保护剂反应，脱去Fmoc基团，然后与mPEG-NHS反应，得到化合物8；3化合物8先与脱保护剂反应，脱去Boc基团，然后与焦脱镁叶绿酸a发生缩合反应，即得；其中，化合物3的结构为化合物7的结构为化合物8的结构为进一步地，步骤1中：所述脱保护剂为TFA；所述脱去BuOt基团的反应中，反应溶剂为二氯甲烷，化合物3、反应溶剂、脱保护试剂的质量体积比为1.60g：10mL：10mL；化合物3与Boc-cystaminehydrochloride的摩尔比为1：4～8，优选为1：6；所述缩合反应是在缩合剂和碱的作用下完成的，优选地，所述缩合剂选自HOBt，HBTU，HOAt，HATU中的一种或多种，所述碱选自DIPEA；更优选地，所述缩合剂选自HOBt和HBTU，且Boc-cystaminehydrochloride与HOBt，HBTU，DIPEA的摩尔比为1：1：1：2～3；所述缩合反应的条件为：先在冰浴下反应1h后，继续在室温下避光反应24～48h；所述缩合反应溶剂为N,N-二甲基酰胺；和或，步骤2中：所述脱保护剂为二乙胺；所述脱去Fmoc基团的反应中，反应溶剂为N,N-二甲基酰胺，化合物7、反应溶剂、脱保护试剂的质量体积比为0.4g：10mL：10mL；所述mPEG-NHS的分子量为2KDa；化合物7与mPEG-NHS的摩尔比为1：4～8，优选为1：6；所述与mPEG-NHS的反应是在碱的作用下完成的，优选地，所述碱选自DIPEA；更优选地，所述mPEG-NHS与DIPEA的摩尔比为1：1.5；所述与mPEG-NHS的反应条件为：室温下避光反应48h；所述与mPEG-NHS的反应溶剂为N,N-二甲基酰胺；和或，步骤3中：所述脱保护剂为TFA；所述脱去Boc基团的反应中，反应溶剂为二氯甲烷，化合物8、反应溶剂、脱保护试剂的质量体积比为0.4g：5mL：5mL；化合物8与Pyropheophorbidea的摩尔比为1：6～10，优选为1：8；所述缩合反应是在缩合剂和碱的作用下完成的，优选地，所述缩合剂选自HOBt，HBTU，HOAt，HATU中的一种或多种，所述碱选自DIPEA；更优选地，所述缩合剂选自HOAt和HATU，且Pyropheophorbidea与HOAt，HATU，DIPEA的摩尔比为1：1.1：1.1：4～5；所述缩合反应的条件为：先在冰浴下反应1h后，继续在室温下避光反应24～48h；所述缩合反应溶剂为N,N-二甲基酰胺。本发明还提供了一种制备上述光动力-化疗联用给药系统的方法，所述方法为：在权利要求1-3任一项所述给药系统的溶液中，滴入阿霉素的溶液，混合均匀，然后在去离子水中自组装，透析，即得球形纳米颗粒。本发明“球形”包括规则和不规则的球形；“纳米颗粒”是指纳米量级的实心或空心颗粒。进一步地，所述给药系统的溶液中：溶剂为极性溶剂，优选为DMF；给药系统与溶剂的质量体积比为30～50：1mgmL，优选为40：1mgmL；所述阿霉素的溶液为阿霉素盐酸盐脱盐后的碱性溶液；所述阿霉素盐酸盐与给药系统的质量比为1：3～5，优选为1：4；所述自组装的方法为：将混合均匀的体系逐滴加入去离子水中，搅拌24小时；所述给药系统与去离子水的质量体积比为4：2～4mgmL，优选为4：3mgmL；所述透析时间为2天，透析采用的透析袋的截留分子量为3500。本发明还提供了上述给药系统或光动力-化疗联用给药系统在制备抗肿瘤药物上的用途，优选地，所述肿瘤选自乳腺癌、膀胱癌、肺癌、食管癌、头颈部癌、皮肤癌。本发明利用π-π堆叠作用和疏水效应，实现了LD型PEG-Peptide线性-树状共聚物-焦脱镁叶绿酸a给药系统PPD-SSP对DOX的物理包载，还利用了肿瘤组织微环境呈现弱酸性的特性，可通过弱酸性条件下DOX会被质子化而实现pH响应性的药物控释。此外，因为Ppa可能与DOX产生较强的π-π堆叠作用导致释放受阻，我们利用对GSH敏感的二硫键偶联Ppa，使光敏剂也可在肿瘤微环境中解离，从而促进包载DOX的释放。因此，我们构建的光动力-化疗联用的抗肿瘤给药系统具备在pH和氧化还原双敏感刺激响应的协同作用下可控释放药物DOX的功能。通过紫外-可见光分光光度计的检测结果表明给药系统PPD-SSPD对Ppa的载药量较高，为14.33％；而对DOX的载药量为6.92％，包封率为30％。说明给药系统PPD-SSP能够通过π-π堆叠作用和疏水效应等非共价作用力有效实现对游离DOX的物理包裹，完全满足光动力-化疗联用对恶性肿瘤治疗的需要。通过扫描电子显微镜、动态光散射技术的表征、临界胶束浓度的测定和光学性质的研究，均表明DOX的包载，不仅对整个给药系统的光学性质没有影响，在水相溶液中依然可以自组装形成均一稳定的纳米颗粒，且这种物理包载方式减小了整个纳米的粒径，使得该具备更优越的肿瘤靶向和滞留功能，活体荧光成像实验的结果表明其在肿瘤部位的有效滞留长达18天。体外药物释放实验表明，该光动力-化疗联用的给药系统成功实现了DOX的有效包载、递送和双敏感响应的可控释放。同时，在细胞水平和动物水平上的研究，证明该光动力-化疗联用的给药系统对恶性肿瘤的治疗存在协同增效的作用。因此，本发明以LD型PEG-Peptide线性-树状共聚物为载体材料构建的光动力-化疗联用的给药系统是一种生物安全性良好的、能在荧光成像的介导下有效抑制恶性肿瘤的、具有协同抗肿瘤作用的新型给药系统，具有很好的应用前景。本发明中，LD型即Linear-Dendritic，表示线性树状结构。自组装self-assembly，是指基本结构单元分子，纳米材料，微米或更大尺度的物质自发形成有序结构的一种技术。在自组装的过程中，基本结构单元在基于非共价键的相互作用下自发的组织或聚集为一个稳定、具有一定规则几何外观的结构。-Boc表示Boc基团，即叔丁氧羰基，结构为Cbz基团即苄氧基羰基，结构为Fmoc基团即笏甲氧羰基，结构为Alloc基团结构为Pht基团结构为PMB基团结构为Bn基团结构为BuOt基团的结构为Boc-cystaminehydrochloride，CAS号93790-49-9，即mPEG-NHS即甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯，mPEG2k-NHS即mPEG-NHS2kDa，是分子量为2KDa的mPEG-NHS。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1：给药系统PPD-SSP的合成路线。图2：给药系统PPD-SSP的自组装，PPD-SSP包载DOX形成PPD-SSPD，PPD-SSPD药物控释示意图。图3：化合物7的核磁氢谱表征。图4：化合物7的MALDI-TOFMS表征。图5：化合物8的MALDI-TOFMS表征。图6：PPD-SSP的MALDI-TOFMS表征。图7：焦脱镁叶绿酸a在DMSO中的标准紫外吸收曲线。图8：阿霉素在DMSO中的标准紫外吸收曲线。图9：PPD-SSPP在DMSO-d6A和D2OB中的核磁氢谱表征。图10：通过扫描电镜表征粒径和形貌：载体材料PPDA、给药系统PPD-SSPB和给药系统PPD-SSPDC。图11：通过DLS表征粒径：给药系统PPD-SSP分别在纯水A和PBS缓冲液中的粒径B；给药系统PPD-SSPD分别在纯水C和PBS缓冲液中的粒径D。图12：通过加入芘测定给药系统PPD-SSP在水中的临界胶束浓度CMC。线性拟合曲线和CMC值的计算通过SigmaPlot12.5软件完成。图13：通过DLS表征粒径，给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD分别在纯水和PBS缓冲液中随时间变化的粒径A和B，以及PPD-SSP和PPD-SSPD分别在纯水和PBS缓冲液中随时间变化的PDIC和D。图14：给药系统PPD-SSP、PPD-SSPD和游离光敏剂Ppa分别在纯水、PBS和DMSO中的溶液颜色。图15：给药系统PPD-SSPA、PPD-SSPDB经不同处理后的紫外-可见光吸收光谱。图16：给药系统PPD-SSPA、PPD-SSPDB和游离DOXC经不同处理后的和荧光发射光谱。图17：给药系统PPD-SSPA、PPD-SSPDB和游离光敏剂PpaC分别在不同溶剂中的光稳定性。图18：给药系统PPD-SSP、PPD-SSPD和游离光敏剂Ppa的DMA消耗曲线和转换拟合曲线。图19：给药系统PPD-SSP、PPD-SSPD和盐酸阿霉素的DSC曲线A；PPD-SSPD在两种pH条件下、及是否加入GSH情况下的药物释放n＝3，温度均为37℃B。图20：体外细胞毒性研究n＝3。给药系统PPD-SSP、PPD-SSPD、游离光敏剂Ppa以及联用下对4T1细胞的毒性，分别以Ppa的浓度计算A和DOX的浓度计算B；PPD-SSP、PPD-SSPD和游离光敏剂Ppa在避光条件下对L02正常细胞的毒性C。图21：通过激光共聚焦显微镜CLSM考察给药系统PPD-SSP、PPD-SSPD、游离光敏剂Ppa和游离DOX在4T1细胞中孵育1h和3h后的细胞摄取。比例尺代表25微米。图22：通过流式细胞仪考察给药系统PPD-SSP、PPD-SSPD和游离光敏剂Ppa在4T1细胞中孵育不同时间后的细胞摄取情况。阳性细胞的荧光强度由FlowJo7.01软件计算。图23：通过活体荧光成像实验比较游离给药系统PPD-SSP、PPD-SSPD和游离光敏剂Ppa在肿瘤模型小鼠体内的分布情况。各组的剂量均为每只小鼠5mgPpakg。图24：定量测定各时间点，给药系统PPD-SSP、PPD-SSPD、游离光敏剂Ppa和游离DOX在正常小鼠中的血液中的含量。各组的剂量均为每只小鼠5mgPpakg。图25：通过4T1体内肿瘤模型比较给药系统PPD-SSP、PPD-SSPD和游离光敏剂Ppa的体内抗肿瘤效果，以生理盐水组为对照n＝5,每次给药剂量:每只5mgPpakgA；在治疗结束后，剖离肿瘤称B；根据瘤重计算抑瘤率C；对所有的肿瘤进行拍照D；通过肿瘤的TUNEL染色，研究不同的治疗组对肿瘤细胞凋亡水平的影响。比例尺代表50微米。具体实施方式本发明所以原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。其中，焦脱镁叶绿酸aPpa，购买于上海先辉医药科技有限公司；H-GluOtBu-OtBu·HCl、Fmoc-LysFmoc-OH吉尔生化上海有限公司；Boc-cystaminehydrochloride购买于上海毕得医药科技有限公司；mPEG-NHS2kDa购买于上海芃硕生物科技有限公司。本发明所用SPF级小鼠均购于成都达硕生物科技有限公司实验动物，并饲养于四川大学华西临床药理实验动物中心级实验动物房。实施例1、本发明给药系统PPD-SSP的制备根据图1所示合成路线，制备化合物9，即本发明给药系统PPD-SSP。1化合物1的合成在氮气保护下，将Fmoc-LysFmoc-OH4.00g,6.78mmol，H-GluOtBu-OtBu·HCl3.01g,10.17mmol，HOBt1.37g,10.17mmol和HBTU3.86g,10.17mmol溶解到20mL的超干N,N-二甲基酰胺中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加DIPEA3.50g,27.12mmol。反应于冰浴下搅拌1h后，继续在室温下反应24h。反应结束后，将反应液稀释到300mL乙酸乙酯中，并在冰浴下依次用饱和NaHCO3溶液，1MHCl溶液及饱和NaCl溶液洗涤，收集有机层先用无水MgSO4进行干燥，再用旋转蒸发仪除去溶剂，得到黄色油状粗产品。最后，通过柱色谱法流动相：体积比CH2Cl2:CH3OH＝40:1对粗产品进行分离纯化，得到纯白色固体化合物1，质量为4.34g，产率为74.6％。1HNMR400MHz,DMSO:δ8.16d,J＝7.2Hz,1H,7.88d,J＝7.5Hz,4H,7.75–7.66m,4H,7.47d,J＝8.2Hz,1H,7.40t,J＝7.4Hz,4H,7.31m,4H,4.22m,8H,2.96s,2H,2.29d,J＝27.5Hz,4H,1.90d,J＝7.7Hz,2H,1.74s,2H,1.37d,J＝6.8Hz,18H,1.23s,2H；ESI-TOFMS:mz＝854.16[M+Na]+。2化合物2的合成在氮气保护下，将化合物12.16g,2.59mmol溶解到10mL的超干二氯甲烷中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加等体积的TFA。反应在冰浴下搅拌1h后，继续在室温下反应5h。反应结束后，用旋转蒸发仪除去溶剂，得到无色油状粗产品。然后，向其中加入无水乙醚并剧烈搅拌，有大量白色沉淀生成，高速离心除去上清液，继续用无水乙醚反复处理三次，将得到的白色沉淀置于真空干燥箱。真空干燥1h后，将白色沉淀，H-GluOtBu-OtBu·HCl2.30g,7.77mmol，HOBt1.05g,7.77mmol和HBTU2.95g,7.77mmol溶解到30mL的超干N,N-二甲基酰胺中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加DIPEA2.68g,20.72mmol。反应于冰浴下搅拌1h后，继续在室温下反应36h。反应结束后，将反应液稀释到300mL乙酸乙酯中，并在冰浴下依次用饱和NaHCO3溶液，1MHCl溶液及饱和NaCl溶液洗涤，收集有机层先用无水MgSO4进行干燥，再用旋转蒸发仪除去部分溶剂。最后，通过重结晶法对粗产品进行分离纯化，得到纯白色固体化合物2，质量为2.49g，产率为80.1％。1HNMR400MHz,DMSO:δ8.17d,J＝7.3Hz,1H,8.03dd,J＝16.8,7.9Hz,2H,7.88d,J＝7.5Hz,4H,7.69dd,J＝18.2,7.4Hz,4H,7.48d,J＝8.0Hz,1H,7.40t,J＝7.5Hz,4H,7.31t,J＝7.5Hz,4H,4.35–3.96m,10H,2.96s,2H,2.35–2.12m,8H,1.96–1.82m,4H,1.78–1.51m,4H,1.36d,J＝1.8Hz,36H；ESI-TOFMS:mz＝1224.40[M+Na]+。3化合物3的合成在氮气保护下，将化合物22.08g,1.73mmol溶解到20mL的超干二氯甲烷中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加等体积的二乙胺。反应在室温下反应6h。反应结束后，用旋转蒸发仪除去溶剂，得到无色油状粗产品。然后，向其中加入无水正己烷并剧烈搅拌，有大量白色沉淀生成，高速离心除去上清液，继续用无水正己烷反复处理三次，将得到的白色沉淀置于真空干燥箱。真空干燥1h后，将白色沉淀，Fmoc-LysFmoc-OH3.06g,5.19mmol，HOBt0.70g,5.19mmol和HBTU1.97g,5.19mmol溶解到40mL的超干N,N-二甲基酰胺中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加DIPEA1.79g,13.84mmol。反应于冰浴下搅拌1h后，继续在室温下反应48h。反应结束后，将反应液稀释到400mL乙酸乙酯中，并在冰浴下依次用饱和NaHCO3溶液，1MHCl溶液及饱和NaCl溶液洗涤，收集有机层先用无水MgSO4进行干燥，再用旋转蒸发仪除去部分溶剂。最后，通过重结晶法对粗产品进行分离纯化，得到白色固体化合物3，质量为2.25g，产率为68.3％。1HNMR400MHz,DMSO:δ8.16d,J＝7.5Hz,1H,8.06d,J＝7.6Hz,1H,7.98d,J＝7.2Hz,1H,7.87d,J＝7.5Hz,8H,7.68dd,J＝17.7,7.1Hz,8H,7.47d,J＝8.1Hz,1H,7.39t,J＝7.3Hz,8H,7.32–7.26m,8H,4.31–3.84m,18H,2.96s,6H,2.21m,8H,1.94–1.81m,4H,1.77–1.59m,6H,1.51d,J＝7.5Hz,6H,1.46–1.30m,36H,1.22m,6H；MALDI-TOFMS:mz＝1925.876[M+Na]+。4化合物7的合成在氮气保护下，将化合物31.60g,0.84mmol溶解到10mL的超干二氯甲烷中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加等体积的TFA三氟乙酸。反应在室温下反应12h。反应结束后，用旋转蒸发仪除去溶剂，得到黄色油状粗产品。然后，向其中加入无水乙醚并剧烈搅拌，有大量白色沉淀生成，高速离心除去上清液，继续用无水乙醚反复处理三次，将得到的黄色沉淀置于真空干燥箱。真空干燥1h后，将黄色沉淀，Boc-cystaminehydrochloride1.46g,5.04mmol，HOBt0.68g,5.04mmol和HBTU1.91g,5.04mmol溶解到40mL的超干N,N-二甲基酰胺中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加DIPEA1.74g,13.44mmol。反应于冰浴下搅拌1h后，继续在室温下反应48h。反应结束后，将反应液稀释到400mL乙酸乙酯中，并在冰浴下依次用饱和NaHCO3溶液，1MHCl溶液及饱和NaCl溶液洗涤，收集有机层先用无水MgSO4进行干燥，再用旋转蒸发仪除去部分溶剂。最后，通过重结晶法对粗产品进行分离纯化，得到黄色固体化合物7，质量为1.35g，产率为61.4％。1HNMR400MHz,DMSO:δ8.20s,4H,7.96d,J＝20.5Hz,5H,7.94–7.84m,8H,7.68dd,J＝15.8,7.4Hz,8H,7.41m,10H,7.30t,J＝7.0Hz,8H,6.96d,J＝3.9Hz,4H,4.24dd,J＝23.5,10.3Hz,18H,3.18d,J＝6.3Hz,8H,2.92d,J＝32.4Hz,14H,2.73d,J＝6.2Hz,16H,2.13d,J＝21.6Hz,12H,1.86s,6H,1.57d,J＝47.7Hz,6H,1.33d,J＝18.1Hz,36H,1.23s,6H图3；MALDI-TOFMS:mz＝2639.218[M+Na]+图4。5化合物8的合成在氮气保护下，将化合物70.4g,0.15mmol溶解到10mL的超干N,N-二甲基酰胺中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加等体积的二乙胺。反应在室温下反应12h。反应结束后，用旋转蒸发仪除去溶剂，得到无色油状粗产品。然后，向其中加入无水正己烷并剧烈搅拌，有大量白色沉淀生成，高速离心除去上清液，继续用无水正己烷反复处理三次，将得到的黄色沉淀置于真空干燥箱。真空干燥1h后，在氩气保护下将黄色沉淀，mPEG2k-NHS1.84g,0.92mmol溶解到10mL的超干N,N-二甲基酰胺中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加DIPEA0.18g,1.38mmol。室温下避光反应48h后，反应液用截留分子量为8000的透析袋在超纯水中透析2天，并通过尺寸排阻色谱柱Superose12HR1630columnonanFPLCsystemGEHealthcarecolumn进一步提纯。最后，在超纯水中再次透析并冷冻干燥，即可获得浅黄色固体化合物8，质量为1.08g，产率为72.5％。MALDI-TOFMS:mz＝9749.05[M+Na]+图5。6化合物9即PPD-SSP的合成在氮气保护下，将化合物8400.0mg,41.1μmol溶解到5mL的超干二氯甲烷中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加等体积的TFA。反应在室温下反应12h。反应结束后，用旋转蒸发仪除去溶剂，得到黄色油状粗产品。然后，向其中加入无水乙醚并剧烈搅拌，有大量白色沉淀生成，高速离心除去上清液，继续用无水乙醚反复处理三次，将得到的黄色沉淀置于真空干燥箱。真空干燥1h后，将黄色沉淀，Pyropheophorbidea175.8mg,328.8μmol，HOAt50.3mg,369.9μmol和HATU140.6mg,369.9μmol溶解到10mL的超干N,N-二甲基酰胺中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加DIPEA191.3mg,1.48mmol。反应于冰浴下搅拌1h后，继续在室温避光下反应48h。反应结束后，反应液用截留分子量为8000的透析袋在超纯水中透析2天，并通过尺寸排阻色谱柱Superose12HR1630columnonanFPLCsystemGEHealthcarecolumn进一步提纯。最后，在超纯水中再次透析并冷冻干燥，即可获得浅黄色固体化合物9，质量为232.7mg，产率为49.7％。MALDI-TOFMS:mz＝11414.82[M+Na]+图6。实施例2、本发明给药系统PPD-SSPD的制备取10mgDOX·HCl阿霉素盐酸盐加入到1mLDMF溶液中，然后加入三倍当量的三乙胺溶液，过夜搅拌。取40mgPPD-SSP溶于1mLDMF，然后将上述DOX的碱性溶液逐滴加入其中，搅拌均匀后将此混合液逐滴加入到30mL去离子水中，剧烈搅拌24h.随后，将其加入截留分子量为3500的透析袋中，并在去离子水中透析2天，经0.45-μm的滤膜过滤后，冷冻干燥除水得到紫黑色固体PPD-SSPD44.3mg。PPD-SSPD的形成示意图如图2所示。同样的实验重复三次，根据如下公式求其载药量Drugloadingcontent,DLC和包封率Drugloadingefficiency,DLE：DLCwt％＝weightofloadeddrugweightofpolymer×100％DLE％＝weightofloadeddrugweightinfeed×100％以下通过实验例证明本发明的有益效果。本发明采用的实验方法如下：1、质谱和核磁共振光谱称取样品1mg左右，充分溶解到相应的溶剂中，并在液相色谱质谱联用仪或基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪上进行测试；称取样品5mg左右，以0.5mL的重水或氘代二甲基亚砜为溶剂将样品充分溶解，并在高分辨超导核磁共振波谱仪上进行测试。2、载药量测试如表1所示，按照设定的浓度梯度10,5,2.5,1.0,0.5,0.25,0.1,0μgmL配制游离光敏剂Ppa的二甲基亚砜溶液，一共8个浓度，用紫外-可见光谱仪在667nm处测定其吸光度，并绘制标准曲线图7。然后，测定一定浓度给药系统PPD-SSP100μgmL的吸光度，带入标准曲线计算材料中Ppa的浓度，最后计算载药量；如表2所示，按照设定的浓度梯度100,50,25,10,5,1,0.5,0μgmL配制游离DOX的二甲基亚砜溶液，一共8个浓度，用紫外-可见光谱仪在481nm处测定其吸光度，并绘制标准曲线图8。然后，分别测定一定浓度给药系统PPD-SSPD100μgmL的吸光度，带入标准曲线计算材料中DOX的浓度，最后计算载药量。表1不同浓度游离光敏剂Ppa的吸光度表2不同浓度游离DOX的吸光度3、差示扫锚量热法为了考察药物在胶束中分散状态，分别精确称取一定质量PPD-SSP、PPD-SSPD、DOX·HCl、DOX·HCl和PPD-SSP物理混合物进行DSC测试，记录升温过程中样品的热量变化，分别绘制各样品的DSC曲线图。测试条件：氮气环境下，升温速率为10℃min，扫描范围为40℃～300℃。4、粒径分布、表面电荷及形貌分别称取给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD样品1mg左右，用超纯水或PBS溶解并配制成浓度为200μgmL溶液。在常温下，利用ZetasizerNanoZS纳米粒度-电位检测仪分别检测给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD样品在水溶液和PBS溶液中纳米颗粒的粒径分布和表面电荷；将200μgmL给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的水溶液分别滴加到干净的硅片上，待其自然风干后，用扫描电子显微镜分别观察其形貌和尺寸。5、紫外-可见光光谱和荧光光谱配制浓度为1mgmL的游离光敏剂Ppa二甲基亚砜溶液，及游离光敏剂Ppa浓度为1mgmL的给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD二甲基亚砜溶液。然后，将这两种溶液分别用不同的溶液DMSO,H2O,PBS,DMSO+0.1％SDS,H2O+0.1％SDS,PBS+0.1％SDS,DMSO+1％SDS,H2O+1％SDS,PBS+1％SDS稀释20倍，在室温下分别测定其紫外-可见光光谱波长范围：300～800nm，以及荧光发射光谱EX：405nmor485nm,Em:500～800nm。为了评价给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的荧光自淬灭和解淬灭效应，我们可根据上述测量的样品在有无表面活性剂的水溶液或有机溶剂中的荧光强度，计算其荧光猝灭效率。记录各组样品的峰值强度，淬灭百分比由下式求得：式中，F0为样品在水溶液中发生猝灭时的荧光强度，F1为样品在有机溶剂中处于分散状态未猝灭时的荧光强度。6、单线态氧量子产率、摩尔消光系数和荧光量子产率1摩尔消光系数Molarextinctioncoefficients,ε根据朗伯-比尔定律，测量计算给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的摩尔消光系数。准确称量并配制含不同浓度光敏剂的给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的DMSO溶液0.01875,0.0375,0.075,0.15,0.3,0.6,1.2x10-6molL。分别将各浓度的样品加入到96孔板中，并用酶标仪测定各孔在668nm处的吸光度。分别根据不同浓度给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的吸光度A对其浓度C作图求得线性关系的斜率，即为摩尔消光系数ε。2荧光量子产率Fluorescentquantumyield,FQ配制浓度为6.0×10-6molL的游离光敏剂Ppa甲苯溶液，及游离光敏剂Ppa浓度为6.0×10-6molL的给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD甲苯溶液，测定其荧光发射光谱EX：660nm,Em:600～750nm。在室温下，同时测定荧光发射光谱的峰面积和样品在660nm的吸光度。采用下式分别求出给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的荧光量子产率ΦΔ:式中，A为660nm处的吸光度；S为荧光发射光谱的峰面积；S为样品，而R为Ppa参照；ref.ΦΔ为游离光敏剂Ppa在甲苯中的单线态氧量子产率0.30。3单线态氧量子产率singletoxygenquantumyield,SOQ通过定量检测9,10-二甲基蒽9,10-dimethylanthracene，DMA捕获1O2后的荧光降低程度可定量测定给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的单线态氧量子产率。分别在给药系统PPD-SSP,PPD-SSPD和Ppa的DMSO溶液中加入一定量的DMA使DMA的终浓度均为6μM。分别将样品加入到96孔板中，采用660nm的激光进行照射80mWcm2，并用酶标仪在各时间点测定DMA的发射光强度Ex:360nm；Em:440nm。按照如下公式计算样品的单线态氧量子产率：式中，A为660nm处的吸光度；K为DMA消耗速率的斜率；S为样品，而R为Ppa参照；ref.ΦΔ为游离光敏剂Ppa在DMSO中的单线态氧量子产率0.50。7、临界胶束浓度采用芘荧光法测量给药系统PPD-SSP在超纯水中的临界胶束浓度CMC。首先，配制浓度为1mgmL给药系统PPD-SSP的母液，并稀释成不同的浓度。其次，准确称取1mg的芘，用5mL丙酮溶解，转移至50mL容量瓶定容，得到浓度为1.0×10-4molL的芘丙酮溶液。然后，用移液枪移取5μL芘丙酮溶液加入到一系列5ml容量瓶中，通N2将丙酮吹干，分别将上述不同浓度的给药系统PPD-SSP溶液移入容量瓶中，得到一系列含芘探针的胶束溶液，浓度分别为50,20,10,5,2,1,0.5,0.2,0.1,0.05,0.02μgmL。最后，将上述胶束溶液置于37℃的恒温振荡器中振荡分散2h，测定芘的荧光激发光谱Em:668nm,Ex:310.0～350.0nm。8、稳定性测试1光稳定性分别将100μL游离光敏剂Ppa的DMSO溶液、水溶液、PBS缓冲液，以及给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的DMSO溶液、水溶液、PBS缓冲液加入到96孔板中，每组设置3个复孔，各组溶液浓度设置均为游离光敏剂Ppa浓度为10μgmL。实验中，用660nm的激光照射所有溶液10分钟5mWcm2，每照射1分钟，便用酶标仪测定一次各孔在667nm处的吸光度或光密度OD值。最后，计算照射后各时间点相对于初始时间点的吸光度或光密度下降的百分比。2胶体稳定性通过监测给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD在模拟生理条件下的尺寸变化来评价其胶体稳定性。将给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD分别加入到含有10％FBS的超纯水和含有10％FBS的PBS中，浓度均为200μgmL溶液。在常温下，利用ZetasizerNanoZS纳米粒度-电位检测仪检测不同时间点给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD在含有10％FBS的超纯水和含10％FBS的PBS中的粒径分布、表面电荷和分散度的变化情况。9、体外释放实验将给药系统PPD-SSPD溶于2mL不同pH值和不同物质的量浓度的DTT磷酸盐缓冲溶pH＝5.2,pH＝5.210mMDTT,pH＝7.4,pH＝7.410mMDTT，将溶液置于截留分子量为2000Da的透析袋中。将透析袋用透析夹夹紧后浸入30mL上述磷酸盐缓冲溶，置于37℃的水平恒温振荡器内进行动态透析频率为170rmin，并开始计时。每隔一段时间后取500μL透析液，每取出500μL透析液后，需要补加相应的等体积缓冲溶。配制盐酸阿霉素DOX标准溶液，用酶标仪测定吸光值激发光波长480nm，发射光波长550nm，取平均值n＝3，作出标准曲线。再用酶标仪测定透析液DOX的含量并计算累积释放量，绘出体外释放曲线。10、细胞系及细胞毒性实验本章研究工作中采用的细胞系为小鼠乳腺癌细胞4T1、非小细胞肺癌耐药株A549-R购于南京凯基生物科技发展有限公司，及人源正常肝细胞L02购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，维持培养条件均为改良型1640培养基Hyclone，且处于37℃和5％CO2环境中培养。培养细胞前，需在培养基中加入10％胎牛血清FBS，Excell，北美洲和1％双抗青霉素和链霉素。为考察光动力-化疗联用给药系统PPD-SSPD的细胞毒性，向处于生长对数期的4T1细胞中分别加入同浓度梯度的游离光敏剂Ppa、给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD进行处理。每个浓度设置3个复孔，并设置无药处理的对照组、含有100μL培养基的培养孔则作为空白对照组。对于需要光照的实验组，需预先避光孵育24h，再按不同时间使用相同的单位面积功率的660nm激光进行照射。随后，再经避光孵育24h，各孔用10mmolL、pH为7.4的PBS清洗2遍，再加入100μL含10％CCK-8试剂的培养基孵育2h，随后用酶标仪BioTek,USA测定其在450nm处的光密度OD值。为了考察给药系统自身可能存在的毒性，采用上述方法将L02细胞接种并培养于96孔的培养板中，再在避光条件下用不同浓度的给药系统PPD-SSP、PPD-SSPD和空白材料PPD进行处理。最后，按相同方法得到不同实验孔的光密度OD值。细胞存活率cellviability均采用以下公式进行计算：Cellviability％＝ODt-OD0ODc-OD0×100％式中，ODt：实验组光密度；OD0：空白组光密度；ODc：对照组光密度。根据各实验组得到的细胞存活率计算各组的半抑制浓度即IC50值，根据IC50值按照如下公式计算联用指数CIcombinationindex：D1：联用中按药物1计算抑制50％时的药物浓度；D2：联用中按药物2计算抑制50％时的药物浓度；D501：单用药物1抑制50％需要的药物浓度；D502：单用药物2抑制50％需要的药物浓度。CI1则表明存在拮抗作用。11、细胞摄取实验通过激光共聚焦显微镜CLSM和流式细胞仪检测给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的细胞摄取情况。激光共聚焦测试：将处于生长对数期的4T1细胞消化后以2×104个细胞皿的数量接种到玻底培养皿中，经48小时的培养使之充分贴壁，加入同浓度1μgmLPpa游离光敏剂Ppa、PPD-SSP和PPD-SSPD分别处理1h、3h和6h。移去旧培养基后，用PBS洗涤2次，再加入4％多聚甲醛缓冲液对细胞进行固定。10min后弃去缓冲液，用CLSM进行观察。激发波长：630nm，发射波长：660nm。流式细胞仪测试：将处于生长对数期的4T1细胞消化后以2×104个细胞皿的数量接种到12孔板中，加入同药物浓度1μgmL的游离光敏剂Ppa、PPD-SSP和PPD-SSPD分别处理2h、6h和24h。按不同的时间点加入待测样品，最后用胰酶消化细胞，1000g离心3分钟收集细胞，用PBS洗涤2次后，离心收集细胞并用流式细胞仪进行荧光检测。波长设置：参照APC的荧光检测条件检测，激发波长：630nm，发射波长：660nm。12、药代动力学实验选择体重为20g左右的健康雌性BALBc小鼠5-6周龄为研究对象进行药代动力学实验。将小鼠随机分为四组，每组7只，一组小鼠尾静脉注射游离光敏剂Ppa，一组小鼠尾静脉注射游离DOX，另两组小鼠分别尾静脉注射给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD，注射剂量均为每只小鼠5mgKg游离光敏剂Ppa或者3mgKg的游离DOX。分别在注射后的5min,15min,30min,1h,2h,4h,8h,12h,24h,36h,48h,72h进行眼眶取血，并加入肝素管中，400W功率超声粉碎10分钟，1000g离心10分钟，取上层血浆清液。最后，利用酶标仪分别建立游离光敏剂Ppa667nm处的吸光度和游离DOX481nm处的吸光度的标准曲线，并再根据标准曲线计算每个血液样品中Ppa或DOX的含量。13、生物分布实验为考察光动力-化疗联用的给药系统PPD-SSPD在4T1模型小鼠体内分布的情况，分别给模型小鼠尾静脉游离光敏剂Ppa、PPD-SSP和PPD-SSPD，注射剂量均为每只小鼠5mgKg的游离光敏剂Ppa或者3mgKg的游离DOX。在1h至18d的时间内1h,6h,12h,24h,3d,5d,7d,9d,11d,14d，用小动物活体成像系统MaestroinvivoimagingsystemCRi,U.S.检测小鼠的荧光信号。14、体内抗肿瘤药效评价本实验以4T1肿瘤模型为研究对象，选择6-8周龄的雌性BALBc小鼠为接种对象建立小鼠乳腺癌皮下移植瘤模型。将培养的4T1细胞重悬到PBS缓冲液中，按5×105只的接种量注射到小鼠后肢及背部相交处的皮下。待肿瘤体积达到50mm3时，将模型小鼠随机分为6组，每组5只，分别为生理盐水对照、游离光敏剂Ppa治疗组、游离DOX治疗组、游离光敏剂Ppa与游离DOX联用治疗组、给药系统PPD-SSP治疗组和光动力-化疗联用的给药系统PPD-SSPD治疗组。治疗方案为：从治疗开始的第1天起，每四天对小鼠进行尾静脉注射一次，每次剂量为每只小鼠6mg游离光敏剂Ppakg和3mgDOXkg。在给药后的第2天按150J·cm2只的剂量对小鼠的肿瘤部位进行660nm的激光照射功率为0.26Wcm2,8min，每4天一次，共治疗3次。在第一次给药后的第17天，安乐处死并解剖小鼠，收集其主要脏器肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏，用10％的中性甲醛缓冲液充分固定，并进行免疫组化分析。同时对剥离后的肿瘤进行拍照记录并称重，按照以下公式计算抑瘤率Tumorgrowthinhibition,TGI：式中，对照组的平均瘤重，实验组的平均瘤重。15、统计学分析所有实验数据用SigmaPlot12.5软件、GraphPadPrism5软件和MicrosoftExcel2010软件进行统计处理。所有结果以means±SEM表示，并采用Student’sttest分析各组数据差异，P＜0.05为统计具有显著性差异。实验例1、本发明光动力-化疗联用的给药系统的通过紫外-可见光分光光度计的检测结果，测得给药系统PPD-SSPD对Ppa的载药量较高，为14.33％；而对DOX的载药量为6.92％，包封率为30％，说明给药系统PPD-SSP能够通过π-π堆叠作用和疏水效应等非共价作用力有效实现对游离DOX的物理包裹，完全满足光动力-化疗联用对恶性肿瘤治疗的需要。实验例2、本发明光动力-化疗联用的给药系统的自组装表征1、自组装体系的结构表征为了验证给药系统PPD-SSP在水相溶液中是否真的存在自组装行为，我们分别以D2O或DMSO-d6溶剂将样品充分溶解，并在高分辨超导核磁共振波谱仪上进行测试。如图9所示，给药系统PPD-SSP在以D2O作为溶剂的氢谱中，光敏剂Ppa的特征峰完全消失，这表明给药系统PPD-SSP在水相溶液中通过自组装形成稳定的纳米结构，将光敏剂Ppa包裹在内部疏水区域，因此其特征峰被完全抑制。2、自组装体系的形貌表征我们用扫描电子显微电镜SEM对未连接游离光敏剂Ppa的空白载体材料PPD、PPD-SSP和PPD-SSPD进行了表征。结果如图10所示，空白材料PPD由于缺乏游离光敏剂Ppa的疏水作用和π-π堆叠作用，无法达到亲疏水的平衡，并没有形成规整的球形结构。而给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD因具有疏水效应、π-π堆叠等分子间的相互作用形成了较为规整的球形纳米颗粒。同时，相对于PPD-SSP，DOX的物理包载使给药系统PPD-SSPD粒径减小。3、自组装体系的粒径表征我们利用动态光散射粒度仪DLS对给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的水相粒径进行了进一步的表征如图11所示，给药系统PPD-SSP在纯水和PBS中的水相粒径相近，为200nm左右；给药系统PPD-SSPD在纯水和PBS中的水相粒径同样相近，为80nm左右。两种给药系统的单分散系数PDI均小于0.3，表明它们均具有良好的单分散性。SEM和DLS的结果均显示给药系统PPD-SSPD的粒径显著小于没有包载DOX的PPD-SSP，可能的原因是Ppa与DOX产生较强的π-π堆叠作用，使得内部的疏水部分进一步压缩，整个的亲疏水平衡发生变化，导致自组装后的粒径更小。4、自组装体系的临界胶束浓度CMC表征我们还通过对临界胶束浓度的测定进一步考察了其组装行为。结果如图12所示，通过对芘探针的荧光测定和线性拟合曲线公式的计算，测得给药系统PPD-SSP在水相的CMC值为2.44μgmL，远低于实际应用中所需要的浓度，表明给药系统PPD-SSP在水相环境非常容易通过自组装而聚集，也适于包载疏水性的药物。5、自组装体系的稳定性表征为进一步研究给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD在体液环境下的稳定性，我们通过在纯水和PBS中加入10％的胎牛血清FBS来模拟体内的体液环境，并将给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD溶解于上述溶液中进行水相粒径的测定实验。结果如图13所示，在两种溶液中，给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD均可在较长的时间内维持相对恒定的粒径大小。其中，在7天的时间内，给药系统PPD-SSP的粒径稳定性明显高于PPD-SSPD。原因可能是随时间的延长，给药系统PPD-SSPD包载的DOX有少量的泄漏或释放，使Ppa与DOX之间的相互作用减弱，内部的疏水部分进一步膨胀，整个的亲疏水平衡再次发生变化，从而导致粒径有一定程度的变大，但其粒径仍能维持一定的稳定性。该结果表明，尽管给药系统PPD-SSPD有一定程度的粒径变化，但整体上给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD在水相所形成的纳米结构在体液环境下均具有较好的稳定性。综合上述的实验结果，给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD能在水相环境中通过自组装形成尺寸均一、单分散性良好、稳定性高且带弱负电荷的纳米颗粒。实验例3、本发明光动力-化疗联用的给药系统的光学性质和光稳定性表征1、紫外-可见光吸收光谱和荧光发射光谱表征为了研究给药系统PPD-SSPD中DOX与游离光敏剂Ppa的相互作用对其光学性质的影响，测定了给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD在不同溶剂环境中的紫外-可见光吸收光谱和荧光发射光谱。首先，游离光敏剂Ppa、PPD-SSP和PPD-SSPD在不同待测溶液中溶解的颜色图14所示仍有着一定的颜色变化，三者在水相和有机溶剂的溶液颜色均有着显著的差别。由于给药系统PPD-SSPD包载了DOX，与PPD-SSP相比，在各溶剂中的颜色均偏红色。同时，在不同溶剂中颜色的差异也表明给药系统在水相中的自组装和药物包载对其产生了一定的影响。紫外-可见光吸收光谱实验的结果则进一步探究了这种影响作用。结果如图15所示，在有机溶剂中游离光敏剂Ppa、游离DOX、给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD均处于完全分散的状态，所对应的特征吸收波长均保持一致。而在纯水或PBS的水相环境中，给药系统、游离光敏剂Ppa和游离DOX的吸收强度均显著低于在有机相中的吸收强度。但在水溶液中加入表面活性剂十二烷基硫酸钠SDS后，给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的聚集结构受到破坏，其特征吸收峰的吸收强度有所增强。荧光发射光谱结果则显示图16所示，405nm和480nm均可激发DOX，480nm激发的发射光强度高于405nm激发的发射光强度，但游离光敏剂Ppa仅在405nm下能被有效激发产生发射光。因此，在405nm下可同时激发产生DOX和游离光敏剂Ppa的发射光谱，这有利于对包载DOX的给药系统PPD-SSPD进行研究。同时，我们发现给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD在不同的溶液环境中仍会发生不同程度的荧光淬灭效应。给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD在有机溶剂中均处于完全分散的状态，不会影响所包载的DOX和共价偶联的光敏剂Ppa的荧光发射光谱，但在纯水和PBS的水相环境中，均会发生荧光淬灭，给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD中Ppa的荧光淬灭率均在95％以上，而给药系统PPD-SSPD中DOX的荧光淬灭率相对较低为86.5％。在水溶液中加入SDS后，其荧光可逐渐恢复，给药系统PPD-SSPD中DOX的荧光恢复程度却明显高于Ppa，两种药物荧光淬灭的差异可能是由于载药方式的差异导致的表3。以上研究表明给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD均能在水相环境中通过自组装聚集诱导荧光淬灭，而当聚集结构被破坏后，其荧光又可恢复。此外，DTT对发射光强度的影响明显低于SDS，这可能因为是虽然DTT打断了二硫键，使光敏剂Ppa脱离了给药系统，但光敏剂Ppa和DOX之间仍存在着一定的分子间相互作用。表3给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD在不同溶剂环境中的荧光淬灭率2、不同溶剂中的光稳定性实验表征我们通过光稳定性实验对游离光敏剂Ppa、给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的光稳定性同时进行了考察。结果如图17所示，在DMSO中，游离光敏剂Ppa、给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的光吸收强度均有一定程度的减弱，但给药系统PPD-SSP减弱的程度显著低于游离光敏剂Ppa和给药系统PPD-SSPD，表明共价偶联光敏剂Ppa到PEG-Peptide线性-树状共聚物上对其有一定的保护作用，同时DOX的包载降低了整个纳米的光稳定性。而在水相环境中，给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD均显示出显著的光稳定性，没有明显的吸光强度下降趋势，而游离光敏剂Ppa仍有一定程度的下降。这可能是由于给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD在水相中的自组装行为对其内部的共价偶联的光敏剂Ppa和物理包裹的DOX均产生了保护作用。光稳定性的实验表明，给药系统PPD-SSP显著提高了游离光敏剂Ppa的光稳定性，DOX的物理包裹并不影响给药系统在水相中的光稳定性，在体内光动力治疗研究中具有潜在应用的前景。实验例4、本发明光动力-化疗联用的给药系统的单线态氧量子产率、摩尔消光系数和荧光量子产率测试摩尔消光系数、荧光量子产率和单线态氧量子产率是比较和评估光敏剂是否理想的重要指标。如表4所示，给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的摩尔消光系数和荧光量子产率并无明显差异，虽然二者均略低于游离光敏剂Ppa，但完全满足理想光敏剂的要求。如图18所示，在660nm激光照射的过程中下，游离光敏剂Ppa、DOX和给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的溶液在370nm的激发光激发下在440nm处均不产生荧光，故可排除光敏剂和DOX本身产生荧光的干扰，且游离光敏剂Ppa或给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的DMA溶液的荧光强度值与光照时间呈一级动力学关系。通过计算，给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的单线态氧量子产率均为0.47略低于游离光敏剂Ppa，表明给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD均具有较强的光敏化作用。以上研究表明，给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD均具有较高的摩尔消光系数和荧光量子产率和单线态氧量子产率，且DOX的包载对给药系统的光物理性质没有明显影响。表4给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的相关光学参数实验例5、本发明光动力-化疗联用的给药系统的药物释放为了进一步验证给药系统PPD-SSP对DOX的物理包载作用，我们对PPD-SSP、PPD-SSPD、DOX·HCl、DOX·HCl和PPD-SSP物理混合物进行了DSC测试。DSC曲线如图19A所示，游离的盐酸阿霉素在231.63℃出现了DOX·HCl的特征吸热峰，DOX·HCl和PPD-SSP的物理混合物在237.60℃也出现了DOX·HCl的特征吸热峰，而DOX·HCl的特征吸热峰在给药系统PPD-SSPD中消失，表明DOX以无定型的状态存在于PPD-SSPD中。为了考察光动力-化疗联用的给药系统PPD-SSPD是否能在特定pH和还原条件下实现响应性药物控释功能，我们比较了给药系统PPD-SSPD在两种pH条件下pH＝5.2对应内吞体或溶酶体中的pH值，pH＝7.4对应血液中的pH值及是否加入还原性谷胱甘肽GSH情况下的药物释放行为。结果显示图19B，在不加入GSH的前提下，给药系统PPD-SSPD在pH7.4生理条件下的释放较慢，且累积释放量较低，至60h时的累积释放量也未明显增加，仅为28.1±0.4％。相反，在弱酸性条件下pH＝5.2，给药系统PPD-SSPD的释放量却显著高于在生理pH条件下的释放量，60h时的累积释放量达到了71.0±0.9％。此外，由于GSH在酸性条件下的还原能力会大幅减弱，因此给药系统PPD-SSPD在pH7.4生理条件下加入GSH显著加快了DOX的释放速率和累积释放量，60h时的累积释放量达到了72.3±0.9％。而给药系统PPD-SSPD在pH5.2条件下加入GSH对释放速率和累积释放量的影响并不不明显，60h时的累积释放量仅增加至78.1±1.9％。以上研究结果表明给药系统PPD-SSPD具备良好pH响应性释放的特性，在生理pH条件下能保持一定的稳定性，而在更低的pH条件下能够释放出游离DOX，并且还具备还原响应性，GSH可进一步加快DOX的释放。因此，给药系统PPD-SSPD既能在血液中保持较好的稳定性，又能在肿瘤组织或细胞的弱酸性和高GSH浓度的环境中更快地释放出药物。实验例6、本发明光动力-化疗联用给药系统的体外细胞评价1、细胞毒性试验为考察给药系统PPD-SSPD是否在抑制肿瘤细胞上存在光动力治疗和化疗协同作用，我们通过CCK-8法研究了PPD-SSPD对4T1小鼠乳腺癌细胞的细胞毒性。两种抗肿瘤药联用时，不同比例所达到的药效不同，可能是协同作用CI1。因此，确定两种药物最佳的联用比例十分重要。如图20和表5所示，游离光敏剂Ppa和游离DOX按照和PPD-SSPD相同的2：1药物比例混合后在抑制4T1细胞上存在一定的协同作用CI＝0.931。相反，通过物理包载DOX的PPD-SSPD在抑制4T1细胞上产生了显著的协同作用CI＝0.771，且其CI值明显低于游离光敏剂Ppa和游离DOX按照相同比例混合后的CI值。这表明我们构建的PPD-SSPD光动力-化疗联用的给药系统显著优于不同游离药物的简单混合，在合适的剂量比例下，可在抑制肿瘤细胞上产生显著的协同作用。表5联用指数CI和IC50值为进一步验证给药系统的安全性，我们考察了给药系统对正常细胞的毒性。如图20C所示，在避光条件即光照射剂量为0J时，游离光敏剂Ppa对L02细胞表现出显著的细胞毒性。而给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD均改善了光敏剂Ppa自身的毒性作用，在避光条件下对L02细胞的毒性明显低于游离光敏剂Ppa，显著提高了细胞的存活率。其中，给药系统PPD-SSPD由于存在DOX的释放，其细胞毒性高于PPD-SSP，但仍低于其对4T1细胞的毒性，表明给药系统PPD-SSPD的细胞毒性具有一定的选择性，这可能是其具备的双敏感响应性药物释放功能导致的。这些结果证明了PEG-Peptide线性-树状共聚物对细胞具有良好的相容性，显著降低了光敏剂Ppa自身对细胞的毒性作用，并对肿瘤细胞具有一定程度的选择性的抑制作用。由此可推测，给药系统PPD-SSP在体内应用时能有效地避免光敏剂和DOX导致的毒副作用。2、细胞摄取实验我们通过对光敏剂Ppa和DOX荧光信号的检测来研究给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD的入胞情况。首先通过激光共聚焦显微镜CLSM观察游离光敏剂Ppa、游离DOX、给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD在胞内的荧光信号强度变化，考察其入胞情况。结果显示图21，游离光敏剂Ppa、游离DOX、给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD均能在孵育1h和3h过程中，在胞内检测到较强的光敏剂Ppa的荧光信号。而游离光敏剂Ppa的入胞速率高于给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD，在所测的时间点均有着更强的荧光信号。此外，游离DOX和给药系统PPD-SSPD均能在孵育1h和3h过程中，在胞内检测到较强的DOX的荧光信号。游离DOX因其分子较小、疏水性强很容易进入细胞核，因而其荧光信号出现在细胞核内。但给药系统PPD-SSPD内的DOX需要经过整个以胞吞方式入胞后再被释放才能表现出荧光信号，因而DOX荧光信号位置和光敏剂Ppa荧光信号的位置基本一致，这表明DOX被给药系统PPD-SSPD稳定包裹。为进一步比较游离光敏剂Ppa、PPD-SSP和PPD-SSPD的入胞效率，我们通过流式细胞仪对胞内的荧光信号强度进行了定量测定。结果如图22所示，游离光敏剂Ppa仍有着更高的入胞速率和入胞量，在2h至6h阶段，游离光敏剂Ppa在胞内荧光强度增加显著，而6h至24h阶段胞内荧光信号强度的增加并不明显。而给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD尽管在各个时间点的胞内荧光信号强度均低于游离光敏剂Ppa，但不同的是它们在整个时间段的胞内荧光信号强度均在持续增加。这表明给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD均改变了光敏剂Ppa的入胞方式，游离光敏剂Ppa可能主要是通过主动转运途径入胞，该途径可因转运体底物浓度过高而饱和，因而入胞速率有先快后慢的变化；而给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD作为纳米颗粒是通过胞吞方式入胞，故而入胞速率较慢，但持续时间更长。此外，给药系统PPD-SSPD有着比PPD-SSP更高的入胞量，这可能是二者粒径不同导致的。结合体外毒性实验的结果，我们发现尽管给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD改变了光敏剂Ppa和DOX的入胞方式，但仍可有效且持续地入胞，并具有优异的肿瘤协同治疗效果。实验例7、本发明光动力-化疗联用给药系统的药动学和生物分布为了进一步验证本发明光动力-化疗联用的给药系统PPD-SSPD是否能改善光敏剂Ppa对肿瘤部位的靶向性，我们构建了小鼠异种移植瘤模型，比较了游离光敏剂Ppa、给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD在荷瘤小鼠体内的分布情况。我们通过荧光活体成像实验进行观测图23，从6h起给药系统PPD-SSP、PPD-SSPD和游离光敏剂Ppa均能在肿瘤部位检测到一定的荧光信号，且给药系统于各时间点在肿瘤部位的荧光信号均强于游离光敏剂Ppa。此外，给药系统PPD-SSP、PPD-SSPD和游离光敏剂Ppa达到最强荧光信号的时间点有所不同。游离光敏剂Ppa则在24h左右达到最强信号，而给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD在肿瘤部位的荧光信号在12h至第3天均出处于最强值，荧光信号强度没有明显衰减。给药系统PPD-SSP和PPD-SSPD在肿瘤部位的荧光信号强度差异主要是二者本身的荧光强度差异和衰减变化不同引起的，给药系统PPD-SSPD在肿瘤部位的荧光信号强度均强于PPD-SSP，且随时间衰减的速度更缓慢，直至第18天仍能在肿瘤部位有较强的荧光信号。研究结果表明，光动力-化疗联用的给药系统PPD-SSPD进一步延长了光敏剂Ppa在肿瘤部位的富集浓度和滞留时间。这既可能进一步增强光动力疗法的治疗效果，而其肿瘤长滞留这一特点，也使得其在治疗过程中对照射的时间选择更为灵活，且在治疗过程还可通过对荧光信号的检测来监测肿瘤的实时变化情况。表6给药系统PPD-SSP，PPD-SSPD和Ppa的药动学参数at12:药物半衰期；bAUC:曲线下峰面积；cCL:清除率；dMRT:平均驻留时间；eVz:表观分布容积表7给药系统PPD-SSPD和DOX的药动学参数at12:药物半衰期；bAUC:曲线下峰面积；cCL:清除率；dMRT:平均驻留时间；eVz:表观分布容积为了进一步研究光动力-化疗联用的给药系统PPD-SSPD对游离光敏剂Ppa和游离DOX体内代谢过程的影响，我们通过对药动学的研究比较了给药系统PPD-SSP、PPD-SSPD、游离光敏剂Ppa和游离DOX注射后在小鼠血液中的浓度变化情况。结果如图24及表6和表7所示，游离光敏剂Ppa在血液会被快速清除，仅能在12h内检测到荧光信号，而游离DOX也仅能在24h内检测到荧光信号，二者均在之后的时间点因低于检测限而无法测定。而给药系统PPD-SSP、PPD-SSPD至72h均仍能检测到荧光信号。给药系统PPD-SSPD有着最长的消除相半衰期，以光敏剂Ppa和DOX为检测对象的半衰期均超过了20h，显著长于游离光敏剂Ppa的4h和游离DOX的8h。同时，给药系统PPD-SSPD的曲线上峰面积AUC、清除率CL和稳态平均滞留时间MRT等这些药动学的参数，均表明给药系统PPD-SSPD显著延长了偶联的光敏剂Ppa和包载的DOX的血液循环时间，为光动力治疗和化疗的联合应用提供了重要基础。实验例8、本发明光动力-化疗联用给药系统的体内抗肿瘤评价为验证光动力-化疗联用的给药系统PPD-SSPD在体内的抗肿瘤效果，我们以4T1小鼠乳腺癌细胞为研究对象，在雌性BALBc小鼠皮下建立了小鼠乳腺癌移植瘤模型。以注射生理盐水Saline的小鼠为对照组，比较了游离光敏剂Ppa治疗组、游离DOX治疗组、游离光敏剂Ppa与游离DOX联用治疗组、给药系统PPD-SSP治疗组和光动力-化疗联用的PPD-SSPD治疗组的体内抗肿瘤效果。结果如图25所示，给药系统PPD-SSPD有着最佳的抗肿瘤效果，显著优于单一的治疗方式，同时凭借给药系统在肿瘤高富集和长滞留的优势，其治疗效果也显著优于游离光敏剂Ppa和游离DOX联合应用的治疗效果。其中，给药系统PPD-SSPD治疗组有3只小鼠的肿瘤在治疗后完全消失，其余小鼠的肿瘤也显著减小。同时，给药系统PPD-SSPD有着显著更高的抑瘤率TGI，为97.90％。给药系统PPD-SSP的抑瘤率仅次于PPD-SSPD，为89.91％。而游离光敏剂Ppa治疗组的抑瘤率仅为26.91％，游离DOX治疗组的为31.35％、游离光敏剂Ppa与游离DOX联用治疗组的为62.76％。为进一步验证给药系统PPD-SSPD的抗肿瘤效果，在抗肿瘤实验结束后，对剖离的肿瘤组织进行切片，考察了提示肿瘤组织中细胞凋亡水平的指标TUNEL的阳性率。实验结果显示图25E，与肿瘤生长抑制的情况相符，给药系统PPD-SSPD可导致肿瘤组织凋亡水平的显著升高，表明经过给药系统PPDP的光动力和化疗联合作用，可有效促进肿瘤细胞的凋亡。综上所述，本发明构建的光动力-化疗联用的给药系统具备多种优势，不仅进一步延长了药物的血液循环时间和滞留时间，提高了其在肿瘤部位的富集强度，还达到了肿瘤光动力和化疗协同增效的目的，同时也实现了对肿瘤治疗过程的实时监测和评估，最终在体内抗肿瘤实验中取得了显著的抑瘤效果。因此，本发明以PEG-Peptide线性-树状共聚物为载体材料构建的光动力-化疗联用的给药系统是一种高安全且能有效地抑制恶性肿瘤的治疗手段，在制备抗肿瘤药物上具有很好的前景。

权利要求：1.一种给药系统，所述给药系统中载有光敏剂焦脱镁叶绿酸a，其特征在于：所述给药系统的结构如式I所示：其中，R1～R4各自独立地选自氨基保护基或且R1～R4中有1～4个n为聚合度，n为44。2.根据权利要求1所述的给药系统，其特征在于：所述氨基保护基选自Boc基团、Cbz基团、Fmoc基团、Alloc基团、Pht基团、PMB基团、Bn基团，优选为Boc基团。3.根据权利要求1或2所述的给药系统，其特征在于：所述给药系统中，焦脱镁叶绿酸a的载药量为5.00％～15.00％，优选为14.33％；焦脱镁叶绿酸a的载药量＝焦脱镁叶绿酸a的质量给药系统总质量×100％。4.一种光动力-化疗联用给药系统，其特征在于：所述光动力-化疗联用给药系统是以权利要求1-3任一项所述给药系统与阿霉素盐酸盐为原料制得的。5.根据权利要求4所述的光动力-化疗联用给药系统，其特征在于：所述光动力-化疗联用给药系统中，阿霉素的载药量为3.00～8.00％，优选为6.92％；阿霉素的载药量＝阿霉素的质量给药系统总质量×100％。6.一种制备权利要求1-3任一项所述给药系统的方法，其特征在于：所述方法包括：1化合物3先与脱保护剂反应，脱去BuOt基团，然后与Boc-cystaminehydrochloride发生缩合反应，得到化合物7；2化合物7先与脱保护剂反应，脱去Fmoc基团，然后与mPEG-NHS反应，得到化合物8；3化合物8先与脱保护剂反应，脱去Boc基团，然后与焦脱镁叶绿酸a发生缩合反应，即得；其中，化合物3的结构为化合物7的结构为化合物8的结构为7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤1中：所述脱保护剂为TFA；所述脱去BuOt基团的反应中，反应溶剂为二氯甲烷，化合物3、反应溶剂、脱保护试剂的质量体积比为1.60g：10mL：10mL；化合物3与Boc-cystaminehydrochloride的摩尔比为1：4～8，优选为1：6；所述缩合反应是在缩合剂和碱的作用下完成的，优选地，所述缩合剂选自HOBt，HBTU，HOAt，HATU中的一种或多种，所述碱选自DIPEA；更优选地，所述缩合剂选自HOBt和HBTU，且Boc-cystaminehydrochloride与HOBt，HBTU，DIPEA的摩尔比为1：1：1：2～3；所述缩合反应的条件为：先在冰浴下反应1h后，继续在室温下避光反应24～48h；所述缩合反应溶剂为N,N-二甲基酰胺；和或，步骤2中：所述脱保护剂为二乙胺；所述脱去Fmoc基团的反应中，反应溶剂为N,N-二甲基酰胺，化合物7、反应溶剂、脱保护试剂的质量体积比为0.4g：10mL：10mL；所述mPEG-NHS的分子量为2KDa；化合物7与mPEG-NHS的摩尔比为1：4～8，优选为1：6；所述与mPEG-NHS的反应是在碱的作用下完成的，优选地，所述碱选自DIPEA；更优选地，所述mPEG-NHS与DIPEA的摩尔比为1：1.5；所述与mPEG-NHS的反应条件为：室温下避光反应48h；所述与mPEG-NHS的反应溶剂为N,N-二甲基酰胺；和或，步骤3中：所述脱保护剂为TFA；所述脱去Boc基团的反应中，反应溶剂为二氯甲烷，化合物8、反应溶剂、脱保护试剂的质量体积比为0.4g：5mL：5mL；化合物8与Pyropheophorbidea的摩尔比为1：6～10，优选为1：8；所述缩合反应是在缩合剂和碱的作用下完成的，优选地，所述缩合剂选自HOBt，HBTU，HOAt，HATU中的一种或多种，所述碱选自DIPEA；更优选地，所述缩合剂选自HOAt和HATU，且Pyropheophorbidea与HOAt，HATU，DIPEA的摩尔比为1：1.1：1.1：4～5；所述缩合反应的条件为：先在冰浴下反应1h后，继续在室温下避光反应24～48h；所述缩合反应溶剂为N,N-二甲基酰胺。8.一种制备权利要求4-5任一项所述光动力-化疗联用给药系统的方法，其特征在于：所述方法为：在权利要求1-3任一项所述给药系统的溶液中，滴入阿霉素的溶液，混合均匀，然后在去离子水中自组装，透析，得到球形纳米颗粒。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述给药系统的溶液中：溶剂为极性溶剂，优选为DMF；给药系统与溶剂的质量体积比为30～50：1mgmL，优选为40：1mgmL；所述阿霉素的溶液为阿霉素盐酸盐脱盐后的碱性溶液；所述阿霉素盐酸盐与给药系统的质量比为1：3～5，优选为1：4；所述自组装的方法为：将混合均匀的体系逐滴加入去离子水中，搅拌24小时；所述给药系统与去离子水的质量体积比为4：2～4mgmL，优选为4：3mgmL；所述透析时间为2天，透析采用的透析袋的截留分子量为3500。10.权利要求1-3任一项所述给药系统或权利要求4-5任一项所述光动力-化疗联用给药系统在制备抗肿瘤药物上的用途，优选地，所述肿瘤选自乳腺癌、膀胱癌、肺癌、食管癌、头颈部癌、皮肤癌。

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