买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

摘要：本发明公开一种能够调控人参达玛烯二醇合酶基因（PgDDS）的转录因子PgMYB2。该转录因子蛋白序列如SEQIDNO.1。编码上述蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO.2。本发明还通过研究该转录因子与玛烯二醇合酶基因（PgDDS）表达之间的关系，发现该PgMYB2转录因子能结合PgDDS启动子中的特定序列从而促进PgDDS的表达，进一步提升人参皂苷的合成与积累，通过研究PgMYB2转录因子在调控人参皂苷合成中的应用，为今后利用基因工程和代谢工程构建转基因人参细胞、毛状根及植株，从而提高人参皂苷产量提供了一个新的策略。

主权项：1.人参PgMYB2基因在促进人参达玛烯二醇合成酶基因表达中的应用，其特征在于，所述PgMYB2基因的序列如SEQIDNO.2所示。

全文数据：人参PgMYB2转录因子及其在调控人参皂苷合成中的应用技术领域本发明属于生物基因工程技术领域，涉及转录因子对靶基因的调控作用，具体是人参PgMYB2转录因子促进达玛烯二醇合成酶DDS基因的表达作用。本发明旨在通过揭示人参皂苷合成途径中关键酶的调控机制，实现皂苷合成与积累水平的提高，具有重要的应用价值。背景技术人参PanaxginsengC.A.Meyer是一种多年生草本植物，具有极高的药用价值。人参中的主要药效成分为人参皂苷，目前已从人参根中分离出50余种人参皂苷单体，大部分人参皂苷单体具有抗肿瘤、抗衰老、抑制细胞凋亡和增强免疫力等重要的药用价值，如Rb1和Rg1有抗衰老的作用，Ra1、Rg3和Rh2有较强的抗癌活性等，部分人参皂苷已广泛应用于临床。尽管许多人参皂苷单体具有抗肿瘤、抗衰老、抑制细胞凋亡和增强免疫力等活性，但是其中大部分活性强的人参皂苷在人参中含量极低，远远不能满足市场需求，要打破此瓶颈依赖于深入研究人参皂苷生物合成的调控机制。人参皂苷生物合成途径中，包括20余步连续的酶促反应。随着人参皂苷合成途径研究的深入，越来越多的合成酶关键基因被克隆出来。其中的关键酶有法呢基焦磷酸合成酶farnesyldiophosphatesynthase，FPS、鲨烯合成酶squalenesynthase，SS、鲨烯环氧酶squaleneepoxidase，SE、达玛烯二醇-II合成酶darmmarenediol-IIsynthase，DDS、β-香树素合成酶β-amyrinsynthase，β-AS、细胞色素P450cytochromeP450，CYP450和糖基转移酶glycosyltransferase，GT等。人参皂苷合成途径中第一个被鉴定出的关键酶是达玛烯二醇-II合成酶DDS，催化2,3-氧化鲨烯环化生成达玛烯二醇，这是人参皂苷合成途径中最重要的支路，是植物中三萜类化合物和甾醇类化合物生物合成的分支。该支路生成的人参皂苷数量、种类最多，在人参中含量最高，经该支路合成的人参皂苷称为达玛烷型人参皂苷。国内外许多研究者对人参PgDDS基因进行了探索，如将人参PgDDS基因转入酵母后能检测到酵母产生达玛烯二醇和羟基达玛烯酮，利用RNAi技术沉默人参愈伤中PgDDS基因并诱导成发根，发现其中皂苷含量降低至原来的84.5％[1]；将PgDDS转入烟草悬浮细胞，转基因悬浮细胞能够产生达玛烯二醇且培养3周后干重中玛烯二醇含量达到573μgg[2]；将人参PgDDS基因转入烟草，发现转基因烟草能够产生玛烯二醇，并且对烟草花叶病毒的抵抗力增强[3]；将人参PgDDS与其他关键酶基因组合转入酿酒酵母，构建了“人参酵母”菌株，能够同时产生皂苷元、齐墩果酸、原人参二醇PPD和原人参三醇PPT，含量分别达到21.4mgL，17.2mgL和15.9mgL[4-6]；水稻中没有DDS，不能合成达玛烷型人参皂苷，将人参PgDDS基因转入水稻，转基因水稻能够高表达达玛烯二醇合成酶并且产生PPD和PPT[7]。这些结果说明DDS对人参皂苷的合成至关重要。MYB蛋白是植物中最大类的转录因子家族，广泛参与植物的生长发育和代谢调控，如次级代谢的调控以及生物和非生物胁迫的应答等，越来越成为植物科学研究的热点。参考文献[1]HanJY,KwonYS,YangDC,etal.ExpressionandRNAinterference-inducedsilencingofthedammarenediolsynthasegeneinPanaxginseng[J].PlantCellPhysiol,2006,4712:1653-1662.[2]HanJY,WangHY,ChoiYE.Productionofdammarenediol-IItriterpeneinacellsuspensioncultureoftransgenictobacco[J].PlantCellRep,2014,332:225-233.[3]LeeMH,HanJY,KimHJ,etal.Dammarenediol-IIproductionconfersTMVtoleranceintransgenictobaccoexpressingPanaxginsengdammarenediol-IIsynthase[J].PlantCellPhysiol,2012,531:173-182.[4]WangP,WeiY,FanY,etal.ProductionofbioactiveginsenosidesRh2andRg3bymetabolicallyengineeredyeasts[J].MetabEng,2015,29:97-105.[5]DaiZ,WangB,LiuY,etal.Producingaglyconsofginsenosidesinbakers'yeast[J].SciRep,2014,4:3698.[6]DaiZ,LiuY,ZhangX,etal.MetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforproductionofginsenosides[J].MetabEng,2013,20:146-156.[7]HuangZ,LinJ,ChengZ,etal.Productionofdammarane-typesapogeninsinricebyexpressingthedammarenediol-IIsynthasegenefromPanaxginsengC.A.Mey[J].PlantSci,2015,239:106-114.以上参考文献的内容是作为背景技术整合到本申请文件中。发明内容本发明旨在提供一种能够间接调控人参皂苷合成的MYB基因，以及该基因编码的转录因子蛋白在调控人参皂苷合成中的应用。为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：所述人参PgMYB2转录因子的序列如SEQIDNO.1所示。编码所述人参PgMYB2转录因子的PgMYB2基因序列如SEQIDNO.2所示。其全长为1401bp，其中第370至1212为编码SEQIDNO.1的序列。扩增PgMYB2基因的引物对序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。本发明人通过生物信息学分析，发现人参PgDDS基因启动子中含有MYB结合位点，基于转录因子能通过DNA结合域与靶基因启动子中特定序列结合这一现象，推测MYB转录因子可能参与人参皂苷的合成和转运的调控。但MYB转录因子是否能调控达玛烯二醇合成酶的表达进而间接调控人参皂苷的生物合成呢？对此问题进行探索有助于完整阐释MYB对人参皂苷合成与积累的调控机制，但是目前在人参中尚未有关MYB对人参皂苷生物合成调控的报道，所以研究人参MYB转录因子对人参皂苷合成和积累的调控显得尤为重要。本发明还提供了含有权利要求2所述的PgMYB2基因的重组载体，具体包括：克隆性载体，命名为重组载体pGEM-TEasy-PgMYB2，即将PgMYB2基因克隆到空载体pGEM-TEasy中，获得重组载体pGEM-TEasy-PgMYB2；植物瞬时表达载体，命名为重组载体pCAMBIA1302-PgMYB2，即将PgMYB2基因克隆到空载体pCAMBIA1302中，获得重组载体pCAMBIA1302-PgMYB2；酵母单杂交猎物载体，命名为pGADT7-PgMYB2，即将PgMYB2基因克隆至空载体pGADT7中，获得重组载体pGADT7-PgMYB2；原核表达载体，pColdTF-PgMYB2，即将PgMYB2基因克隆到空载体pColdTF中，获得重组载体pColdTF-PgMYB2；报告基因效应载体，命名为pEGADMYC-PgMYB2，即将PgMYB2基因克隆到空载体pEGADMYC中，获得重组载体pEGADMYC-PgMYB2。将PgMYB2基因重组至已知载体中，并在合适的体系中进行表达的本领域技术人员熟知的技术。因此，除上述明示的重组载体外，还可以有其他的含PgMYB2基因的重组载体。通过重组载体，转染人参悬浮细胞，使人参基因中过表达PgMYB2基因序列。通过此方法可以获得人参毛状根或转基因植株。由此方法获得的人参毛状根或转基因植株，具有PgDDS的高表达。本领域技术人员熟知如何获得人参悬浮细胞，并熟知通过重组载体，将PgMYB2基因整合到人参悬浮细胞中，从而获得人参毛状根或转基因植株。参见图1至图9，本发明利用现有的植物基因工程技术，利用特异性的引物，通过PCR技术得到PgMYB2基因序列，并通过发根农杆菌介导法将基因导入洋葱内表皮细胞，确定了PgMYB2的亚细胞定位。同时发现PgMYB2基因在人参各组织中均有表达，100μMMeJA能够诱导PgMYB2基因表达上调。进一步的EMSA及荧光素酶报告基因活性等实验表明PgMYB2蛋白能够与PgDDS启动子区域中的MBSII位点结合，并促进PgDDS基因的表达。附图说明图1PCR扩增PgMYB2产物凝胶电泳结果，M为基因Marker；图2为PgMYB2蛋白保守结构域a、亚细胞定位b及跨膜结构域预测c；图3PgMYB2蛋白在洋葱中的亚细胞定位分析图示：图a-d为对照组表达定位情况，e-h为GFP-PgMYB2融合蛋白表达定位情况；图4Realtime-PCR检测4年生新鲜人参不同组织中PgMYB2相对表达情况；图5Realtime-PCR检测100μMMeJA处理人参发根不同时间后PgMYB2与PgDDS基因相对表达情况；图6酵母单杂交检测PgMYB2与PgDDS启动子区域互作结果：左图为在不含有AbA的SD-Ura-Leu固体培养基上各组酵母的生长情况，右图为在含有200ngmLAbA的SD-Ura-Leu固体培养基上各组酵母的生长情况；图7EMSA探究PgMYB2蛋白与PgDDS启动子区域中MBSII位点的结合作用，各体系成分如表2所示；图8PgMYB2在拟南芥原生质体瞬时表达的相对荧光素酶活性，各组说明如表3所示；图9Realtime-PCR检测人参叶片中PgMYB2和PgDDS的相对表达水平，EV1-3为注射pCAMBIA1302空载质粒的人参叶片：OV1-3为注射pCAMBIA1302-PgMYB2过表达质粒的人参叶片。具体实施方式实施例1PgMYB2基因的克隆1人参发根培养体系的建立1.112MS固、液培养基的配置：①母液的配制a.10×大量元素母液加ddH2O溶解，最终定容至1L，灭菌后4℃保存；b.200×微量元素母液加ddH2O溶解，最终定容至500mL，4℃保存；c.100×有机母液加ddH2O溶解，最终定容至500mL，4℃保存；d.100×铁盐母液Na2EDTA·2H2O3.725gFeSO4·7H2O2.785g加ddH2O溶解，最终定容至1L，置于棕色瓶4℃保存。②12MS培养基配方③培养基的配制按表中用量先加入各种母液，再加入称取好的肌醇和蔗糖，用一定量ddH2O溶解后，再加入称取的琼脂粉，置于微波炉加热，待琼脂完全溶解后，补足ddH2O定容至1L，充分搅拌混匀，用NaOH溶液将酸碱度调为pH6.0。培基配好后，分装到100mL锥形瓶中，每瓶30-40mL，液体培养基则无需加琼脂粉，直接定容后分装即可。封瓶膜封口后，用绳子系紧。④培养基的灭菌将所有封装好的锥形瓶放入立式压力蒸汽灭菌器中进行灭菌，设置为121℃，101kPa，20min。灭菌结束后，取出摇匀，凝固好后将培养瓶放置在电热恒温培养箱中2-3d，待确认无菌体污染后方可用于人参发根的培养。1.2人参发根组织培养及激素诱导处理将镊子、培养基和酒精棉等放入超净工作台中，紫外照射20min。①固体培养用镊子取适量生长状态较好的发根，接到12MS固体培基中，尽量分散，然后封好瓶口，在24℃培养箱中进行暗培养，定期观察生长状态及染菌情况。每30-40d继代一次。②液体培养用镊子取适量生长状态较好的发根，接至12MS液体培基中，封口膜封好瓶口。24℃，110rpm振荡培养箱中暗培养，定期观察生长状态及染菌情况，通常10d进行一次继代。③MeJA诱导处理人参发根a.处理组：取46μLMeJA溶于454μL乙醇，再加500μLddH2O，配成终浓度为200mM的MeJA母液，用0.22μm滤器过滤除菌，每10mL液体培养基加入5μL母液至使用浓度为100μM；对照组：取454μL乙醇溶于546μLddH2O中，用0.22μm滤器过滤除菌，每10mL液体培养基加入10μL。b.将固体培养基长势较好的人参发根接种于上述液体培养基，120rpm，24℃暗培养，在不同时间点0，1，3，6，12，24，36，48，72h各取出一瓶处理组与对照组，将发根移入1.5mL离心管中，放入液氮保存，用于后续RNA的提取。2人参发根总RNA的提取Tip头、离心管、研钵、镊子、勺子管架等需在用前置于浓度为1‰的DEPC水中浸泡超过12h，高温灭菌烘干后方可使用。参考OMEGA公司的E.Z.N.A.PlantRNAKit说明提取总RNA。3cDNA第一条链的合成采用Thermo公司的RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒，进行cDNA第一条链的合成。合成的cDNA第一链可直接做为模板进行PCR。4PgMYB2基因的克隆4.1PCR扩增所用试剂为TaKaRa公司的ExTaq酶，引物为Invitrogen公司合成，引物序列如下：PrimerSequence5＇→3＇PgMYB2-FCCACTCTCAACGCATTCTCSEQIDNO.3PgMYB2-RTAGGGGTAGGCACATTCTGSEQIDNO.4反应体系：PCR反应条件：4.2PCR产物胶回收所用试剂盒为WizardSVGelandPCRClean-upsystemkitPromega，参考说明书进行切胶回收。4.3pGEM-TEasy载体连接胶回收的PCR产物采用pGEM-TEasyVectorSystemPromega,USA连接，连接体系：连接时需注意回收片段与pGEM-TEasyVector摩尔比为1:3-1:5，该比例连接效率较高。孵育：4℃过夜，或者室温1h。4.4DH5α感受态细胞的制备①挑取-80℃保存的DH5α菌株于LB固体平板划线活化，37℃培养；②挑取单菌落，接于5mLLB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养12-16h；③将5mL菌液转接于500mLLB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养1-2h，待OD600值为0.4-0.6时迅速转至冰上，冰浴30min；④将500mL菌液按80mL一份分装转至无菌离心管中，4℃，4,000rpm，离心10min，弃上清；⑤向离心管中加入20mL预冷的0.1M的CaCl2溶液，重悬菌液，冰浴30min后，4℃，4,000rpm，离心10min，弃上清；⑥向离心管中加入4mL预冷的0.1M的CaCl2溶液含15％体积的甘油，重悬菌液，冰浴10min，分装至无菌的1.5mL离心管中，迅速放入-80℃冰箱保存。4.5连接产物转化及筛选①从-80℃冰箱取出DH5α感受态细胞，于冰上解冻后，取100μL加入5μL连接产物，轻弹混匀，冰浴30min；②将离心管置于42℃水浴锅，60-90s，取出后立即放到冰上，放置3min；③向离心管中加入500μL的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养1h；④取100μL菌液涂到含Amp的LB平板上，37℃过夜培养；⑤挑取白色单菌落于5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养提取质粒DNA鉴定。4.6质粒的提取质粒提取试剂盒为CWBIO公司的PurePlasmidMiniKit。参照试剂盒说明提取。4.7DNA测序及序列生物信息学分析①DNA测序将含有目的片段的质粒送Invitrogen公司进行DNA测序。②氨基酸序列分析a.保守结构域分析：NCBI网站http:www.ncbi.nlm.nih.gov的ConservedDomainSearchServiceCDSearch程序；b.蛋白质理化性质分析：ExPASy网站的Protparam工具；c.蛋白跨膜结构域分析：TMHMMSERVER2.0；d.蛋白二级结构分析：用ExPASy网站的GOR工具；e.蛋白三级结构分析：Phyre2网站和Swiss-Model在线预测软件。实施例2PgMYB2的亚细胞定位及表达分析1农杆菌介导PgMYB2在洋葱内表皮的亚细胞定位实验1.1PCR扩增于Invitrogen公司合成两端加有载体同源臂的引物，用康维世纪的TaqMasterMix扩增：PrimerSequence5＇→3＇1302-PgMYB2-FAGAACACGGGGGACTCTTGACCAAGAAGAAATTGACGACGATGSEQIDNO.51302-PgMYB2-RGTGAAAAGTTCTTCTCCTTTACTATTCCTTTTCCCAACAGTCCSEQIDNO.6反应体系：PCR反应条件：1.2产物的纯化所用试剂盒为WizardSVGelandPCRClean-upsystemkitPromega，参考说明书进行切胶回收。1.3酶切体系1.4纯化产物与表达载体的同源重组连接采用ClonExpressTMIIonestepcloningkitVazyme进行同源重组。37℃孵育30min。1.5YEB固、液培养基的配置1.6农杆菌感受态细胞制备①取-80℃冰箱保存的农杆菌菌株于YEB固体平板含Rif50mgL划线活化，28℃培养2d；②挑取单个菌落，接于5mLYEB液体培养基含Rif50mgL中，28℃，220rpm，振荡培养24h；③将5mL菌液转接200mLYEB液体培养基含Rif50mgL中，28℃，220rpm振荡培养4-7h，待OD600值为0.4-0.6时迅速转至冰上，冰浴30min；④将菌液转至无菌离心管中，4℃，5,000rpm冷冻离心5min，弃上清；⑤加入20mL预冷的0.1MCaCl2溶液，用移液枪吹吸重悬细胞，冰浴30min，4℃，5,000rpm，离心5min，弃上清；⑥加入1mL预冷的0.1MCaCl2溶液和150μL预冷的甘油，移液枪吹吸重悬细胞，冰浴10min，1.5mL离心管分装后，迅速放入-80℃冰箱保存。1.7植物表达载体转化农杆菌采用液氮直接转化法将构建好的pCAMBIA1302-PgMYB2转化根癌农杆菌是EHA105。具体步骤如下：①从-80℃冰箱取出装有EHA105农杆菌感受态细胞的1.5mL离心管，于冰上解冻，向50μL农杆菌感受态细胞中加入重组质粒0.1-1μg5-10μL，轻弹混匀，冰浴30min；②将离心管放入液氮，骤冷处理5min，迅速转入37℃，水浴5min，取出后立即放到冰上，放置5min；③向离心管中加入1mL的YEB液体培养基，28℃，200rpm，振荡培养4h；④取100μL菌液涂到YEB平板含Rif100μgmL，Kan50μgmL上，先正置放于28℃培养箱中，培养48h，挑取单菌落，进行鉴定。1.8重组农杆菌侵染洋葱内表皮细胞a.取-80℃冰箱保存的含重组载体的农杆菌菌株，于YEB固体平板含Rif50mgL，Kan50mgL划线活化，28℃培养；b.挑取单个菌落，接于5mLYEB液体培养基含Kan50mgL中，28℃，220rpm，振荡培养过夜；c.取1mL过夜培养的菌液接于10mLYEB液体培养基含Kan50mgL中，28℃，200rpm培养18～22hOD600约为0.5；d.菌液转至无菌离心管，4,000rpm离心10min，弃上清，加入5mL12MS液体培养基含终浓度为100μM的AS，移液枪吹打重悬菌体，28℃，200rpm培养3～4h；e.用解剖刀切取下表面积1.0cm2左右的洋葱组织块，于75％乙醇消毒lmin，12MS液体培养基冲洗一次，2％次氯酸钠溶液消毒2min，12MS液体培养基冲洗3～4次，将消毒处理好的洋葱组织块放入4MNaCl溶液中处理20min，清水冲洗一次，迅速侵染；f.向培养3-4h后的农杆菌菌液中加入几滴吐温20，然后将洋葱块置入悬浮液，侵染90min；g.将侵染后的洋葱取出，无菌滤纸吸干表面菌液，分离出下表皮，置于不含抗性的MS固体平板上，26℃下暗培养36-48h；h.将共培养36-48h的洋葱下表皮取出，无菌水清洗两次，制作装片，载玻片上滴加几滴10％的甘油，平铺洋葱下表皮，盖上盖玻片，荧光显微镜观察，拍照。2Real-timePCR表达分析试剂采用CWBIO的ΜLtraSYBRMixtureWithROX，以4年生新鲜人参的不同组织和用100μMMeJA处理不同时间的发根中提取的RNA逆转录得到的cDNA为模板，以β-actin为内参，以表1中引物进行Real-timePCR扩增，每个样品重复3次。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，数据结果采用2-△△Ct方法计算基因表达水平的差异，采用SPSS15.0分析软件进行统计分析。表1Real-timePCR分析所用引物反应体系：反应程序：实施例3PgMYB2与DDSpro的互作分析1PCR扩增于北京睿博兴科生物技术有限公司合成的带酶切位点的引物，用TransStartFastPfuDNAPolymerase进行扩增。A、启动子序列扩增：反应体系：PCR反应程序：B、PgMYB2基因扩增：PrimerSequence5＇→3＇pGADT7-PgMYB2-FCATATGGCCATGGAGGCCAGTATGATGGGACGTTCACCTTGCSEQIDNO.15pGADT7-PgMYB2-RATCTGCAGCTCGAGCTCGATGTCTATTCCTTTTCCCAACAGTCCSEQIDNO.16反应体系：反应程序：2PCR产物胶回收所用试剂盒为WizardSVGelandPCRClean-upsystemkitPromega，参考说明书进行切胶回收。3利用Gibson法将目的基因克隆pGADT7载体中，将DDS基因克隆至pAbAi载体中。配好重组体系后50℃放置1h：4将3中的重组质粒转化至DH5α中。①从-80℃冰箱取出DH5α感受态细胞，于冰上解冻后，取100μL加入5μL连接产物，轻弹混匀，冰浴30min；②将离心管置于42℃水浴锅，60-90s，取出后立即放到冰上，放置3min；③向离心管中加入500μL的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养1h；④取100μL菌液涂到含Amp的LB平板上，37℃过夜培养；⑤挑取白色单菌落做菌落PCR鉴定。5挑取4中呈阳性结果的菌落于5mL加有Amp的液体LB培养基中，37℃过夜培养后提取质粒。6将构建成功的pAbAi-DDSpro载体即，将DDS启动子基因克隆至pAbAi载体中构建的载体用BbsI酶切线性化。酶切体系配好后放置于65℃2h：7将6中酶切后的产物进行胶回收。回收步骤同实例4中的2。8将7中回收的产物转化至酵母Y1HGold中，酵母转化步骤如下：A酵母感受态制备①从平板上挑取Y1HGold至适量的YPDA培养基中，28℃180rpm过夜培养②摇好的酵母菌液转移至1.5mLEP管中，室温下5000g离心5min。③去上清，用1mL无菌水洗涤菌体沉淀，室温下5000g离心5min。④去上清，用100μL1×TELiAc重悬菌体。B酵母转化①加入待转质粒单转大于200ng，双转大于300ng及10μLCarrierDNA鲑精DNA。②加入600μL1×PEG4000LiAcTE，上下颠倒充分混匀剧烈混匀，可用涡旋。③30℃，200rpm，30min。④加入70μLDMSO，迅速上下颠倒混匀。⑤42℃水浴15min。⑥冰上放置1min冰浴时间过长会使PEG析出呈现白色沉淀，瞬时离心至最大转速后停留5s。⑦去上清，加300μL1×TE重悬。⑧取100μL左右涂SD-Ura平板梯度涂平板，涂平板量视情况而定，30℃倒置培养2-4天。9挑取8中的单菌落做菌落PCR鉴定①取中等大小的酵母菌斑一半，溶解于30μL0.2％SDS溶液中，振荡15s；②90℃金属浴4min；③离心1min，最大转速，吸上清倒干净的新管子里，作为crudeDNA可储存于-20℃。PCR体系为：反应程序：④用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。10将8和9中鉴定呈阳性的酵母用SD-Ura培养基28℃180rpm过夜培养。11ABA抗性检测①鉴定阳性克隆后，取1-2个阳性克隆，重悬于1mL0.9％的NaCl溶液中；②以空细胞做阴性对照，测量时空培养基作为空对照，调整OD600至0.002大约2000cells100μL；③涂布150μL菌液到准备好的4种培养板，30℃培养2-3天12观察11中的结果，确定最佳的AbA浓度。13将pGADT7-PgMYB2质粒转化至9中的酵母中。转化步骤同上，但最后涂的平板为SD-Ura-Leu并且加有浓度200ngmL的AbA。14观察13中的结果，并挑取单菌落重新划线至SD-Ura-Leu的培养基中，培养验证。实施例4EMSA体外分析PgMYB2转录因子蛋白与MBSII位点的结合作用1原核表达质粒pColdTF-PgMYB2的构建A、根据ClonExpressTMIIonestepcloningkit说明书设计带有原核表达载体pColdTF同源臂的引物，用Invitrogen公司合成，序列如下：PrimerSequence5＇→3＇pColdTF-PgMYB2-FATGGAGCTCGGTACCCTCGAGATGGGACGTTCACCTTGCSEQIDNO.17pColdTF-PgMYB2-RAGACTGCAGGTCGACAAGCTTATGTTTTCCCAACAGATGASEQIDNO.18PCR体系为：反应程序：PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测并进行胶回收纯化，步骤同上。B、pColdTF质粒双酶切pColdTF质粒1μgXhol-Re-Mix2μLHindIII-HF1μL将酶反应体系置于37℃水浴1-2h后，回收酶反应产物，回收步骤同上。C、将PCR产物与pColdTF酶切质粒同源重组，并将同源重组产物转化BL21DE3、筛选鉴定，步骤同实例1。2PgMYB2转录因子蛋白诱导表达1挑取阳性菌落于3mL液体LB培养基，37℃，180rpm，振荡培养过夜；2按1:100吸取1mL菌液转移至100mL液体LB中扩大培养，置于37℃，150rpm，振荡培养至OD600＝0.4-0.6；3向菌液中加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，150rpm，持续诱导4h；4菌液分装至两个50mL离心管中，4℃，4,800rpm离心15min收集菌体；5弃上清，加入2mL预冷的PBS重悬菌体，4℃，4,800rpm离心15min；6弃上清，每g湿重加入2-5mL裂解液，重悬菌液；取10μL全菌液于一新的500μL离心管中，加入等体积2×SDS上样缓冲液混匀；7加入溶菌酶1mgmL和核酸酶3UmL，冰上孵育30min；8用超声破碎仪，样品冰上放置进行超声，超声6次，每次10s，间歇10s，功率200-300W；4℃，10,000×g离心20min；3PgMYB2蛋白大量纯化1取1mlNi-NTA悬浮液至15mL离心管中，4℃，瞬时离心，用微量移液器小心吸掉上清，向树脂中加入2mLLysisbuffer，颠倒混匀。24℃，瞬时离心，用微量移液器小心吸掉上清，将2中超声后的上清加入树脂中，于4℃轻摇孵育60min；3将上述混合物转移至纯化柱中，打开底帽使上清液慢慢流出并收集流出液，用于SDS-PAGE检测；4向柱床中缓慢加入2.5mL5×柱床体积的Washbuffer洗2次，洗去杂蛋白，收集流出液用于SDS-PAGE检测；5向柱床中缓慢加入1mLElutionbuffer洗4次，收集流出液于4个离心管中检测洗脱峰。4BCA法测蛋白浓度1按照A液：B液＝50：1配置BCA工作液，充分混匀；2将蛋白标准品2mgmL逐级稀释至1，0.5，0.25，0.125，0.0625mgmL；3每种浓度的蛋白标准品各取20μL置于96孔板中，每个样品三个复孔，将待测样品稀释10倍，取20μL置于96孔板中，设置三个复孔；4每个反应孔中加入200μLBCA工作液，将96孔板置于37℃孵育15-30min；5用酶标仪检测OD570值，并根据测定值绘制标准曲线，计算蛋白样品浓度。5凝胶迁移阻滞实验EMSA1EMSA所用试剂配方①5×TBE：②6.5％PAGE胶配方：2EMSA实验组及对照组设计如下表：表2EMSA实验组及对照组设计组分表体积单位均为μLX代表pColdTF空载体表达的对照蛋白，Y代表PgMYB2:TF融合蛋白。为了避免非特异性反应，在加入生物素标记的探针之前应将总体系在室温下反应5min，全程避免涡旋。加入探针后室温下静置反应20min。3电泳①预电泳：用预冷的0.5×TBE在冰上，100V预电泳30min；②在上样前用ddH2O和电泳缓冲液分别洗加样孔3-5次；③电泳：反应结束后加入Loadingbuffer混匀后电泳，当溴酚蓝电泳至胶的23-34位置时停止电泳100V，60min，具体时间可随胶浓度和探针大小调整，没有结合的探针紧随溴酚蓝。4转膜①转膜前，膜需要在0.5×TBE中浸泡至少10min；②转膜时需用非常干净的镊子、无粉手套夹膜的一个小角；③转膜必须用干净的海绵，不能用WB中用过的海绵；④转膜电压100V，30min。5交联凝胶成像仪紫外交联15min，正面朝下。6洗膜①以下用的试剂体积适用于10×10cm的膜，如果所用膜偏大或者偏小，可以适当调整试剂体积；将膜置于干净的玻璃皿中；②提前将封闭液和4×WashBuffer置于37-50℃水浴预热，直至所有组分充分溶解；向玻璃皿中加入16mL封闭液，慢摇封闭15min时间可延长；③制备结合液封闭液：取50μL的StabilizdeStreptavidin-HorseradishPeroxidaseConjugate加入到16mL的封闭液中1:300的稀释；④倒掉②中封闭液，然后加入③中的结合封闭液，慢摇孵育15min时间可延长至45min；⑤准备1×Washsolution：加40mL的4×WashBuffer至120mL的超纯水，将膜转移至新的容器中，加入20mL的1×Washsolution慢摇漂洗5min；⑥重复第⑤步3次总共漂洗4次；⑦将膜转移至另一个新的容器中，加入30mL的SubstrateEquilibrationBuffer，慢摇孵育5min；7显影①制备化学发光反应液：将6mLLuminolEnhancersolution加入到6mLStablePeroxidesolution日光或者任何强光照都会损害发光工作液，最好将发光工作液保存在棕色瓶子中，并且避免长时间的光照。短时间曝光在标准实验室日光灯下不会对工作液有影响；②将膜取出，小心吸干，将膜平铺在干净的塑料薄膜表面，将化学发光液加到膜表面使溶液完全覆盖膜表面，静止孵育5min；③将膜取出，并吸干残留buffer，但不能让膜干燥，用保鲜膜包裹湿润的膜，避免产生气泡和褶皱。用凝胶成像仪，X射线下曝光2-5min。实施例5拟南芥原生质体中PgMYB2对PgDDS的调控作用分析1PCR扩增A、DDS启动子序列扩增用PrimerPremier5.0软件设计引物扩增DDS启动子全长，正向引物带有Spe酶切位点，反向引物带有NcoI酶切位点，用Invitrogen公司合成，序列如下：PrimerSequence5＇→3＇LUC-DDSpro-FGACTAGTTTCTTCCAATACTTGTAGSEQIDNO.19LUC-DDSpro-RCATGCCATGGCATTCTTAAGTCTACTACSEQIDNO.20反应体系：PCR反应条件：B、PgMYB2序列扩增用PrimerPremier5.0软件设计引物扩增PgMYB2全长，正向引物带有EcoRI酶切位点，反向引物带有BamHI酶切位点，用Invitrogen公司合成，序列如下：PrimerSequence5＇→3＇pEGAD-PgMYB2-FCCGGAATTCATGGGACGTTCACCTTGCSEQIDNO.21pEGAD-PgMYB2-RCGCGGATCCACAATATCTGTAAAACCCASEQIDNO.22反应体系：PCR反应条件：2PCR产物胶回收所用试剂盒为WizardSVGelandPCRClean-upsystemkitPromega，参考说明书进行切胶回收。3载体质粒酶切pGreenII0800-LUC质粒用Spe和NcoI进行酶切，pEGADMYC质粒用EcoRI和BamHI进行酶切，酶反应液置于37℃水浴2h，体系如下：4PCR纯化产物与载体双酶切产物连接5连接产物转化、筛选、提质粒如实施实例1中步骤4.5-4.7。6重组质粒共转拟南芥原生质体并检测双荧光素酶活性按如下组合进行共转，所有对原生质体的操作，必须将枪头减掉尖端并保持平滑，从而减少吹打混匀时所产生的剪切力对原生质体的伤害；步骤如下：1按下表分组中取相应质量的质粒进行实验：表3双荧光素酶报告基因实验组及对照组设计组分表2称取0.2gcelluLaseR-10solarbio和0.08gmacerozymeR-10solarbio加入到20mL酶储液中溶解，于55℃水浴10min，冷却后加入200μL1MCaCl2和0.02gBSA0.1％；3摘取拟南芥叶片，挑选4周后、抽苔前的，健康、生长状态良好的嫩绿色肥厚叶片每个转化约10片，切除叶前缘和叶柄，用刀片将叶片切成1mm宽细条，置于酶解液中，避光，23℃，40-50rpm酶解2.5-3h；4将酶解液用100-200目筛子过滤于50mL离心管中，4℃，70×g，brake＝4，离心5min；5弃上清，将沉淀用4mL冰浴的W5溶液轻柔吹散洗涤，4℃，70×g，brake＝4，离心5min；6弃上清，将沉淀再次用4mL冰浴的W5溶液轻柔吹散，冰上避光放置30min；723℃室温，70×g，brake＝4，离心5min，弃上清，按每个转化加100μLMMG溶液，将沉淀用MMG溶液轻柔重悬；8按表3中的组分取相应质量的质粒于1.5mL离心管中，加入100μL步骤6中的原生质体，轻柔混匀；9加入110μLPEG-Ca溶液，迅速轻柔混匀，防止原生质体结块，室温放置20-30min；10向离心管中加入440μLW5溶液，轻柔混匀，23℃室温，70×g，brake＝4，离心5min；11弃上清，加入500μLW5溶液，轻柔混匀洗涤，23℃室温，70×g，brake＝4，离心5min；12弃上清，加入500μLW5溶液，轻柔混匀，移入清洗干净并用W5溶液润洗过的12孔板中，用W5溶液补齐至1mL，稍微混匀；1323℃至于拟南芥培养箱中，避光培养6-18h；14用ReporterAssaySystemPromega检测双荧光素酶活性。实施例6人参叶片中瞬时表达PgMYB2的作用分析1挑取实施例2中含pCAMBIA1302-PgMYB2过表达质粒的EHA105菌落于1mL含有相应抗生素的液体LB培养基中，置于28℃恒温摇床中，250rpm培养24h，挑取含pCAMBIA1302质粒的EHA105作为对照组，处理方式均相同；2取100μL浓度为0.5M的MESpH＝5.7和2μL浓度为100mM的乙酰丁香酮溶液添加至5mL相应抗生素的LB中，再接种50μL步骤1中培养的菌液，28℃，250rpm扩大约16h至OD600＝1.0左右；323℃，4,000×g离心10min，弃上清，收集菌体沉淀，用10mMMgCl2溶液重悬菌体沉淀至OD600＝1.0，根据重悬液的体积，按每毫升重悬液2μL的比例加入适量100mM乙酰丁香酮，轻轻混匀，室温下静置3h以上；4取两个月左右、处于生长旺盛期的人参叶片，用1mL无菌注射器吸取农杆菌悬浮液，以手指轻抵叶片正面，将菌液从叶片反面注射进去，为方便注射，可用无菌刀片在叶片上划出一小道伤口，再将菌液沿伤口注入，每种菌液至少取三片叶片进行注射；5将注射后的人参植株置于25℃培养箱中培养2d，每天给予16h光照和8h暗处理；收集各组人参叶片，提取RNA，利用RT-PCR和Realtime-PCR检测相关基因的表达水平，步骤均同实施例2。SEQUENCELISTING中南大学人参PgMYB2转录因子及其在调控人参皂苷合成中的应用1122PatentInversion3.51280PRT人工合成1MetGlyArgSerProCysCysGluLysAlaHisThrAsnLysGlyAla151015TrpThrLysGluGluAspGlnArgLeuIleAsnTyrIleArgLeuHis202530GlyGluGlyCysTrpArgSerLeuProLysSerAlaGlyLeuLeuArg354045CysGlyLysSerCysArgLeuArgTrpIleAsnTyrLeuArgProAsp505560LeuLysArgGlyAsnPheThrGluGluGluAspGluLeuIleIleLys65707580LeuHisSerLeuLeuGlyAsnLysTrpSerLeuIleAlaGlyArgLeu859095ProGlyArgThrAspAsnGluIleLysAsnTyrTrpAsnThrHisIle100105110LysArgLysLeuIleSerArgGlyLeuAspProGlnThrHisArgPro115120125LeuAsnAlaThrAlaThrAlaAlaThrAlaIleThrAlaThrSerLeu130135140AspPheArgAsnThrValProSerAsnIleIleProThrGluAsnAsn145150155160IleTyrLysLeuLysThrGluSerLeuGluAspGlyAsnCysSerSer165170175SerThrThrGluGluThrGlnGlnHisGlnGlnTyrPheAlaLysPhe180185190GlnAsnSerGlnValLeuAspLeuGluLeuSerIleGlyLeuProSer195200205SerArgThrGlnThrAsnAspSerSerLeuSerValAsnSerIleGlu210215220SerAsnValArgArgGlnPheMetMetValAlaProProLeuProVal225230235240LeuSerThrThrValAlaProArgMetCysLeuCysTrpLysLeuGly245250255PheGlnLysGlyGlyGlnGlnGlnGlnLeuCysSerAsnCysLysSer260265270ThrSerGlyPheTyrArgTyrCys27528021401DNA人工合成2gaaagagaaaagaaaaatagatgatcgcgagtctattggctacactccctgtttctccct60tatttctcctccctccactctcaacgcattctctctcctcctttttaccttccccctctc120cacatacttccttcttatatctgtctctctttcttcccacttctttcaataaaactctga180cctctctaaaaactctcttctctctctctccttcctcagctttctttcagtcttatctct240atatcatcaacaatctacaacagtacacataaggccccttatccatttactctctctata300tatctctcttcctttaagctgtatatatattacagagaaaaattaaggagctagaagaaa360ttgacgacgatgggtcgttcaccttgctgcgagaaagctcataccaacaaaggcgcctgg420accaaagaagaagatcaacgcctcatcaactatatccggcttcacggcgaaggctgctgg480cgttccctccccaagtccgccggattattgagatgcgggaagagttgcagattacggtgg540ataaactacctccggccagacctaaagagagggaatttcacagaagaagaagatgagcta600attatcaagcttcacagtttgctgggaaacaaatggtctttgatagctggaagattaccc660ggaaggactgataatgaaatcaagaactactggaacacccacatcaaacggaaactcatc720agccgtggactcgacccgcaaactcaccggccgctaaacgccactgccacggctgccaca780gctatcaccgccacgtctctagacttcagaaacactgttccatcaaatattatacccacc840gaaaacaacatatacaagctcaaaacggagtccctggaagatggaaactgcagtagcagc900acaactgaagaaacacagcaacatcaacaatatttcgccaaattccaaaacagtcaagtt960ctagacctcgagttatcgataggactcccgagttcacggactcagactaatgattcctcg1020ttatccgtaaactcgatcgagtctaatgttcggcgccagttcatgatggtggctccgccg1080ttgccagttctgtcaacgacggtggccccacggatgtgtttgtgttggaagttagggttt1140cagaaaggaggtcagcagcagcagttgtgtagtaattgcaaaagcacaagtgggttttac1200agatattgttgactgttgggaaaatgaatagaactgtactctagttgttaggttttagat1260atttaatgtttttattacttactattactcctaccatcagaatgtgcctacccctaccac1320caaatgtaatcaatccatttgcacaccaatatttactagacaaattataaatagagtggt1380gaaactaatttatcttgtgac1401319DNA人工合成3ccactctcaacgcattctc19419DNA人工合成4taggggtaggcacattctg19543DNA人工合成5agaacacgggggactcttgaccaagaagaaattgacgacgatg43643DNA人工合成6gtgaaaagttcttctcctttactattccttttcccaacagtcc43718DNA人工合成7cggattattgagatgcgg18823DNA人工合成8tgatgtgggtgttccagtagttc23921DNA人工合成9tgagattagatgaaaacgaac211021DNA人工合成10ggcaatgataaggggaggtgt211118DNA人工合成11gcggttgaggtggtgggt181220DNA人工合成12gtcctactaacaaggcagag201342DNA人工合成13aattcgagctcggtacccgggcttgtagttttgtgattttcc421442DNA人工合成14atacagagcacatgcctcgagacttgttggtatgtggtgtaa421542DNA人工合成15catatggccatggaggccagtatgatgggacgttcaccttgc421644DNA人工合成16atctgcagctcgagctcgatgtctattccttttcccaacagtcc441739DNA人工合成17atggagctcggtaccctcgagatgggacgttcaccttgc391840DNA人工合成18agactgcaggtcgacaagcttatgttttcccaacagatga401925DNA人工合成19gactagtttcttccaatacttgtag252028DNA人工合成20catgccatggcattcttaagtctactac282127DNA人工合成21ccggaattcatgggacgttcaccttgc272228DNA人工合成22cgcggatccacaatatctgtaaaaccca28

权利要求：1.一种促进达玛烯二醇合成酶基因表达的人参PgMYB2转录因子，其特征在于，所述人参PgMYB2转录因子的序列如SEQIDNO.1所示。2.编码权利要求1所述人参PgMYB2转录因子的PgMYB2基因，其特征在于，所述PgMYB2基因序列如SEQIDNO.2所示。3.一种用于扩增权利要求2所述PgMYB2基因的引物对，其特征在于，所述引物对序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体中包括空载体和权利要求2所述的PgMYB2基因。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述空载体选自pGEM-TEasy、pCAMBIA1302、pColdTF、pGADT7、pEGADMYC。6.根据权利要求2所述人参PgMYB2基因在调控人参皂苷合成中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是人参PgMYB2转录因子通过调控人参PgDDS基因表达来调控人参皂苷的合成。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用是通过具有PgMYB2基因的过表达质粒，转染至人参悬浮细胞中。9.一种人参毛状根，其是通过在人参基因组中过表达PgMYB2基因序列后获得的。10.一种人参转基因植株，其是通过在人参基因组中过表达PgMYB2基因序列后获得的。

百度查询： 中南大学 人参PgMYB2转录因子及其在调控人参皂苷合成中的应用