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申请/专利权人：西北农林科技大学

摘要：本发明涉及一种秦川肉牛肌内脂肪细胞的分离纯化和鉴定方法，使用II型胶原酶对秦川肉牛背最长肌进行消化，经II型胶原酶消化后的组织块用含有10％胎牛血清的DMEMF12培养基中和，经过滤、离心得到细胞，细胞再经洗涤、离心后重悬于含有10％FBS的DMEMF12培养基中，计数后，将细胞接种在培养皿中，在CO2培养箱中培养1.5小时，用无菌磷酸缓冲盐溶液洗涤除去非粘附细胞，然后将细胞培养在37℃、CO2浓度为5％的培养箱中，每隔2天换一次培养基，待细胞汇合度达到70％‑80％后，进行细胞免疫荧光标记阳性细胞鉴定。该方法获得的肉牛肌内脂肪细胞具有较高的前脂肪细胞阳性比率，为提高肌内脂肪沉积的同时不增加皮下及内脏脂肪沉积的研究奠定了基础。

主权项：1.一种秦川肉牛肌内脂肪细胞的分离方法，其特征在于，按下列步骤实施：1将无菌条件下分离的4日龄秦川肉牛背最长肌组织，用PBS加2％的青霉素和链霉素清洁，然后切成1mm3～2mm3的组织块；2将组织块加入离心管中，用II型胶原酶消化，经II型胶原酶消化后的组织块用含有10％FBS的DMEMF12培养基中和，然后用70目和200目的不锈钢筛网进行过滤，将得到的滤液以1500rpm离心10分钟，弃去上清液，得到细胞；3将得到的细胞用无血清DMEMF12培养基重悬并以1500rpm离心10分钟，离心后洗涤两次；4洗涤后的细胞重悬于含有10％FBS的DMEMF12培养基中，计数后，将细胞以2.5×105个细胞的密度接种在培养皿中；将培养皿置于CO2浓度为5％的培养箱中培养1.5小时，然后用无菌PBS洗涤以除去非粘附细胞，并用新鲜的含有10％FBS的DMEMF12培养基替换培养皿中的原培养基；5将细胞培养在37℃、CO2浓度为5％的培养箱中，每隔2天换一次新鲜的含有10％FBS的DMEMF12培养基，待细胞汇合度到达到70％-80％后，使用前脂肪细胞特异性标记Pref-1进行细胞免疫荧光标记阳性细胞鉴定；所述的细胞免疫荧光标记阳性细胞鉴定操作步骤如下：使用前将细胞接种在6孔培养板中加入含有10％FBS的DMEMF12培养基培养，当细胞汇合达到70％时，弃去含有10％FBS的DMEMF12培养基并用PBS洗涤细胞，在室温下用浓度为4％的多聚甲醛将细胞固定30分钟，并再次用PBS洗涤；在室温下用浓度为0.1％的牛血清白蛋白和浓度为0.5％的非离子表面活性剂TritonX-100使细胞通透60分钟，然后弃去液体，然后用PBS再次洗涤，在室温下使用浓度为3％的BSA封闭60分钟；弃去封闭溶液，并加入足够量的稀释的鼠Pref-1抗体，并在4℃孵育过夜，然后弃去鼠Pref-1抗体，加入稀释的抗鼠HRP荧光二抗，37℃孵育80min，弃去二抗后用PBST洗3次，每次3min；然后滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚避光孵育5min，用PBST洗4次去除多余的4',6-二脒基-2-苯基吲哚，每次5min；最后将液体吸干，并在荧光显微镜下观察图像。

全文数据：一种秦川肉牛肌内脂肪细胞分离的方法技术领域本发明属于细胞生物学、细胞工程技术领域，具体涉及一种秦川肉牛肌内脂肪细胞的分离方法。背景技术家畜体内有4个主要脂肪组织位置：内脏，皮下，肌肉内和肌肉间。肌肉内脂肪组织的积累是非常重要的，而脂肪组织在其他位置的过量积累是对畜牧生产的负担，大大增加生产成本，常见的表型是，某些动物比同类动物大得多，主要不是肌肉内脂肪组织的积累，而主要是皮下或内脏脂肪的积累。然而，到目前为止，导致肌内脂肪优先积累的机制仍然定义不明确。脂肪细胞，特别是肌内脂肪细胞，在胎儿肌肉发育过程中与肌原细胞拥有共同的祖细胞。探索间充质祖细胞向肌源性或脂肪纤维母细胞谱系早期分化的机制将有助于了解肌内脂肪细胞的优先形成，从而促进大理石花纹沉积的机理。与这个概念一致，越来越多的证据显示肌内脂肪细胞与皮下和内脏脂肪细胞相比表现不同，因此，探索肌内脂肪细胞的独特发育起源和性质，实现增强牛肉大理石花纹，而不提高动物的整体肥胖的目标，是申请人研究的课题之一。发明内容本发明的目的在于，提供一种秦川肉牛肌内脂肪细胞的分离方法，为探究肌内脂肪的沉积调控机制奠定基础。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：一种秦川肉牛肌内脂肪细胞的分离方法，其特征在于，按下列步骤实施：1将无菌条件下分离的4日龄秦川肉牛背最长肌组织，用PBS加2％的青霉素和链霉素清洁，然后切成1mm3～2mm3的组织块；2将组织块加入离心管中，用II型胶原酶消化，经II型胶原酶消化后的组织块用含有10％FBS的DMEMF12培养基中和，然后用70目和200目的不锈钢筛网进行过滤，将得到的滤液以1500rpm离心10分钟，弃去上清液，得到细胞；3将得到的细胞用无血清DMEMF12培养基重悬并以1500rpm离心10分钟，离心后洗涤两次；4洗涤后的细胞重悬于含有10％FBS的DMEMF12培养基中，计数后，将细胞以2.5×105个细胞的密度接种在培养皿中，将培养皿置于CO2浓度为5％的培养箱中1.5小时，然后用无菌PBS洗涤以除去非粘附细胞，并用新鲜的含有10％FBS的DMEMF12培养基替换培养皿中的原培养基；5将细胞培养在37℃、CO2浓度为5％的培养箱中，每隔2天换一次新鲜的含有10％FBS的DMEMF12培养基，待细胞汇合度到达到70％后，使用前脂肪细胞特异性标记Pref-1通过细胞免疫荧光的方法进行阳性细胞鉴定。根据本发明，所述的细胞免疫荧光鉴定阳性细胞操作步骤如下：使用前将细胞接种在6孔培养板中加入含有10％FBS的DMEMF12培养基培养，当细胞汇合达到70％时，弃去含有10％FBS的DMEMF12培养基并用PBS洗涤细胞，在室温下用浓度为4％的多聚甲醛将细胞固定30分钟，并再次用PBS洗涤；在室温下用浓度为0.1％的BSA和浓度为0.5％的TritonX-100使细胞通透60分钟，弃去液体，然后用PBS再次洗涤，在室温下使用浓度为3％的BSA封闭60分钟；弃去封闭溶液，并加入足够量的稀释的鼠Pref-1抗体一抗，并在4℃孵育过夜，然后弃去鼠Pref-1抗体，加入稀释的抗鼠HRP荧光二抗，37℃孵育80min，弃去二抗后用PBST洗3次，每次3min。后滴加DAPI避光孵育5min，用PBST洗4次去除多余的DAPI，每次5min。最后将液体吸干，并在荧光显微镜下观察结果。本发明的秦川肉牛肌内脂肪细胞的分离方法，与现有技术相比，具有以下优点：1获得的秦川肉牛肌内脂肪细胞，具有高的前脂肪细胞阳性比率；2无污染；3通过采用II型胶原酶消化4日龄秦川肉牛背最长肌组织获得的肌内脂肪细胞，显著提高了从肌肉组织中获得肌内脂肪细胞的阳性细胞比率，并大大降低了脂肪细胞污染的风险。同时，使用pref-1抗体免疫荧光标记前脂肪细胞，为前体脂肪细胞的分离鉴定提供了一种新的方法，也为提高肌内脂肪沉积的同时不增加皮下及内脏脂肪沉积的研究奠定了基础。附图说明图1是秦川肉牛肌内脂肪细胞接种后的第0d，2d，4d图中标记为D0，D2，D4后显微镜下观察得到的照片200×；图2是使用前脂肪细胞特异表达因子Pref-1鉴定前脂肪细胞的免疫荧光照片40×；图3是Western-blot检测前脂肪细胞特异表达因子Pref-1蛋白的表达量。下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。具体实施方式申请人在研究过程中通过试验比较发现，使用II型胶原酶消化秦川肉牛犊牛背最长肌可以获得更多的阳性前脂肪细胞，与其他方法如I型胶原酶消化，或者与成年牛背最长肌为样品获得的肌内脂肪细胞存在一定差异。申请人经过使用不同年龄段牛背最长肌组织，不同的胶原酶，不同的消化时间以及不同的差速贴壁时间进行比较发现，初生牛出生0-1周的背最长肌组织经过II型胶原酶1.5小时消化，接种后1.5小时后更换新鲜培养基可以获得更多的阳性前脂肪细胞。同时，利用免疫荧光等方法，进一步提高了鉴定肌内前体脂肪细胞的可靠性。在以下的实施例中，所涉及的动物组织、试剂来源如下：4日龄犊牛，来自国家肉牛改良中心实验农场中国陕西杨凌；II型胶原酶，DAPI购自GIBCO公司。FBS，DMEMF12，PBS培养基购自Hyclone公司。细胞培养皿及离心管购自Corning公司。浓度为4％的多聚甲醛和PBST购自索莱宝公司。4',6-二脒基-2-苯基吲哚4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI、BSA和非离子表面活性剂TritonX-100以下简称TritonX-100购自sigma公司。鼠Pref-1抗体一抗以及抗鼠HRP荧光二抗均购自abcam公司。本实施例给出的秦川肉牛肌内脂肪细胞的分离方法，具体按下列步骤实施：1将无菌条件下分离的4日龄秦川肉牛背最长肌组织，用PBS加2％的青霉素和链霉素清洁，然后切成1mm3～2mm3的组织块；2将组织块加入离心管中，用II型胶原酶消化，经II型胶原酶消化后的组织块用含有10％FBS的DMEMF12培养基中和，然后用70目和200目的不锈钢筛网进行过滤，将得到的滤液以1500rpm离心10分钟，弃去上清液，得到细胞；3将得到的细胞用无血清DMEMF12培养基并以1500rpm离心10分钟，离心后洗涤两次；4洗涤后的细胞重悬于含有10％FBS的DMEMF12培养基培养中，计数后，将细胞以2.5×105个细胞的密度接种在培养皿中，将培养皿置于浓度为5％的CO2培养箱中1.5小时，在显微镜下观察发现有少量细胞贴壁，然后用无菌PBS洗涤以除去非粘附细胞，并用新鲜的含有10％FBS的DMEMF12培养基替换培养皿中的原培养基；接种2d后观察发现细胞呈指数倍数增长，接种4d后观察发现细胞基本达到100％汇合，无污染现象图1。5将细胞培养在37℃、CO2浓度为5％的培养箱中，每隔2天换一次新鲜的含有10％FBS的DMEMF12培养基，待细胞汇合度到达到70％后，使用前脂肪细胞特异性标记Pref-1通过细胞免疫荧光的方法进行阳性细胞鉴定。上述细胞免疫荧光鉴定阳性细胞操作步骤如下：使用前将细胞接种在6孔培养板中加入含有10％FBS的DMEMF12培养基培养，当细胞汇合达到70％时，弃去含有10％FBS的DMEMF12培养基并用PBS洗涤细胞，在室温下用浓度为4％的多聚甲醛将细胞固定30分钟，并再次用PBS洗涤；在室温下用浓度为0.1％的牛血清白蛋白和浓度为0.5％的TritonX-100使细胞通透60分钟，弃去液体，然后用PBS再次洗涤，在室温下使用浓度为3％的BSA封闭60分钟；弃去封闭溶液，并加入足够量的稀释的鼠Pref-1抗体一抗，并在4℃孵育过夜，然后弃去鼠Pref-1抗体，加入稀释的抗鼠HRP荧光二抗，37℃孵育80min，弃去二抗后用PBST洗3次，每次3min。后滴加DAPI避光孵育5min，用PBST洗4次去除多余的DAPI，每次5min。最后将液体吸干，并在荧光显微镜下观察结果，鉴定所分离细胞中前体脂肪细胞比例。经计数后发现，前体脂肪细胞免疫阳性细胞达到91.33％±0.03图2。对达到接触抑制的细胞进行诱导分化，分别收取第0d，2d，4d，6d图中标记为D0，D2，D4，D6的细胞总蛋白，检测前体脂肪细胞特异性标记Pref-1蛋白表达量，发现Pref-1蛋白呈下降趋势图3，表明所分离细胞为前体脂肪细胞。

权利要求：1.一种秦川肉牛肌内脂肪细胞的分离方法，其特征在于，按下列步骤实施：1将无菌条件下分离的4日龄秦川肉牛背最长肌组织，用PBS加2％的青霉素和链霉素清洁，然后切成1mm3～2mm3的组织块；2将组织块加入离心管中，用II型胶原酶消化，经II型胶原酶消化后的组织块用含有10％FBS的DMEMF12培养基中和，然后用70目和200目的不锈钢筛网进行过滤，将得到的滤液以1500rpm离心10分钟，弃去上清液，得到细胞；3将得到的细胞用无血清DMEMF12培养基重悬并以1500rpm离心10分钟，离心后洗涤两次；4洗涤后的细胞重悬于含有10％FBS的DMEMF12培养基中，计数后，将细胞以2.5×105个细胞的密度接种在培养皿中；将培养皿置于CO2浓度为5％的培养箱中培养1.5小时，然后用无菌PBS洗涤以除去非粘附细胞，并用新鲜的含有10％FBS的DMEMF12培养基替换培养皿中的原培养基；5将细胞培养在37℃、CO2浓度为5％的培养箱中，每隔2天换一次新鲜的含有10％FBS的DMEMF12培养基，待细胞汇合度到达到70％-80％后，使用前脂肪细胞特异性标记Pref-1进行细胞免疫荧光标记阳性细胞鉴定。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞免疫荧光标记阳性细胞操作步骤如下：使用前将细胞接种在6孔培养板中加入含有10％FBS的DMEMF12培养基培养，当细胞汇合达到70％时，弃去含有10％FBS的DMEMF12培养基并用PBS洗涤细胞，在室温下用浓度为4％的多聚甲醛将细胞固定30分钟，并再次用PBS洗涤；在室温下用浓度为0.1％的牛血清白蛋白和浓度为0.5％的非离子表面活性剂TritonX-100使细胞通透60分钟，然后弃去液体，然后用PBS再次洗涤，在室温下使用浓度为3％的BSA封闭60分钟；弃去封闭溶液，并加入足够量的稀释的鼠Pref-1抗体，并在4℃孵育过夜，然后弃去鼠Pref-1抗体，加入稀释的抗鼠HRP荧光二抗，37℃孵育80min，弃去二抗后用PBST洗3次，每次3min，后滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI避光孵育5min，用PBST洗4次去除多余的DAPI，每次5min；最后将液体吸干，并在荧光显微镜下观察图像。

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