买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：丁少峰;刘强

摘要：通过全新的引物设计，多重焦磷酸化激活性聚合反应使用多对阻断性引物在一个反应内扩增位于同一位点的多个几乎相同序列的模板，大大提高了核酸扩增的工作效率。

主权项：1.用于在一个焦磷酸化激活性聚合反应中扩增多个模板的多对正向和反向阻断性引物，其特征在于，所述多个模板位于基因组的同一个位点并且彼此间具有至少一个核苷酸的差异，所述位点为基因组中40bp的核苷酸序列短区域，所述多对正向和反向阻断性引物为3'末端阻断性引物，包括：a用于扩增第一模板的第一对正向和反向引物，其中选择正向引物或反向引物，在其5'区域中引入一个或两个人工突变，和b用于扩增第二模板的第二对正向和反向引物，其中选择与第一对引物中5'区域突变的引物相同方向的正向或反向引物，在其5'区域中引入一个或两个人工突变，并且在模板序列中，第一对和第二对引物中引入的人工突变位于不同的核苷酸处。

全文数据：多重焦磷酸化激活性聚合反应在一个反应内扩増单位点多个序列几乎完全相同的t旲板[0001]序列表[0002]本申请同时提交序列表。技术领域[0003]本发明涉及分子生物学领域，特别涉及焦磷酸化激活性聚合反应扩增核酸。背景技术[0004]现有技术的描述[0005]PAP技术用于核酸扩增[0006]焦磷酸化激活性聚合反应Pyrophosphorolysisactivatedpolymerization，以下简称PAP是一种使用3’末端阻断性引物，利用DNA聚合酶的焦磷酸化反应串联耦合聚合反应的一种核酸扩增方法LiuandSommer，2000;LiuandSommer，2004b。其引物在3’末端由不可延伸的核苷酸3’末端阻断剂例如双脱氧核苷酸所封闭，因而不能直接被DNA聚合酶所延伸。当3’末端阻断性引物与其互补性DNA模板杂交时，在焦磷酸或其类似物的存在下DNA聚合酶可以从3’末端阻断性引物上去除其3’末端阻断剂，这一反应称为焦磷酸化反应。然后DNA聚合酶继而能延伸DNA模板上已去除3’末端阻断剂的引物。除了本文所引用的参考文献，PAP已经在美国专利6，534，269，7，033，763，7，105，298，7，238，480，7，504，221，7,914,995,和7,919,253中所描述。[0007]在PAP中使用了3’末端阻断性引物，使得焦磷酸化反应和聚合反应的串联耦合具有极高的选择性（LiuandSommer，2004a;LiuandSommer，2004b，因为一个显著的可导致假阳性的非特异性扩增第二类错误需要不匹配性焦磷酸化反应加上随即发生的由DNA聚合酶产生的错误掺入性延伸反应，而这种串联错误事件的发生概率估计为3.3ΧΠΓ11。[0008]双向形式的PAPBi-PAP特别适用于等位基因特异性扩增，使用两个相对应的3’末端阻断性引物，其3’末端的单个核苷酸相互重叠（LiuandSommer，2004a;LiuandSommer，2004bAi-PAP可以在IO9个野生型DNA模板存在的情况下检测到一个拷贝等位基因的突变而没有假阳性扩增。[0009]DNA-PAP[0010]PAP的最初测试采用了人类多巴胺Dl基因DNA为模板并使用了Tfl和Taq聚合酶，证明了DNA依赖性DNA焦磷酸化反应和DNA依赖性DNA聚合反应可以串联耦合（LiuandSommer，2000。当PAP用于其它DNA模板时则使用了TaqFS，一个经过基因工程改造而含有F667Y突变的聚合酶，从而证明了可大大提高PAP的效率LiuandSommer,2002。[0011]RNA-PAP[0012]后来发明的RNA-PAP可直接扩增RNA模板而无需另外的制备。RNA-PAP开创了RNA模板扩增的新机制，其中RNA依赖性DNA焦磷酸化移除了杂交于RNA模板上的3’末端阻断剂如3’末端双脱氧核苷酸，然后RNA依赖性DNA聚合反应则延伸被激活的引物。基于这种串联偶联，RNA-PAP对RNA模板上的不匹配具有高度的选择性，导致了RNA模板的高度特异性扩增美国专利号9，133,491。[0013]使用无环核苷酸为阻断剂及II型聚合酶[0014]我们已证明II型DNA聚合酶可有效地催化焦磷酸化反应，激活用2-羟基乙氧基甲基取代2’-脱氧呋喃核糖基糖的无环核苷酸为3’末端阻断剂的引物。除了I型DNA聚合酶外，II型DNA聚合酶Ventexo_和Pfuexo_也用于了以无环核苷酸为阻断性引物的PAP反应LiuandSommer，2004c〇[0015]多位点多重PAP:多对引物在多位点上扩增多个模板[0016]因为极少甚至没有生成引物的二聚体产物及错配产物LiuandSommer，2002，PAP可在一个反应中使用多对引物（彡2来扩增多个位点（彡2上的多个模板（彡2Liueta1.，2006。在多位点多重PAP实例中使用了八对引物来扩增人类基因组的八个位点，其中包括七个沿着人类凝血因子IX基因30Kb序列分布在不同外显子和一个位于人类ATM基因外显子。[0017]单位点双重PAP的交互抑制作用：多对阻断性引物在一个位点扩增多个几乎相同序列的模板[0018]起初我们设计了许多单重PAP反应来检测人类基因组AT单位点双等位基因多态性，例如Rs4261和Rs31224位点。每个多态性都含有一个A或T核苷酸表1。[0019]对于单位点双等位基因多态性Rs4261，将第一对阻断性引物SEQIDNo2和3按照常规设计为5’完全匹配引物，其与A等位基因模板SEQID1匹配，但是在3’末端与T等位基因模板SEQID4不匹配表1。因此单重PAP扩增了A等位基因模板，但是不能扩增T等位基因t吴板。[0020]第二对阻断性引物（SEQIDNo5和6也按照常规设计为5’完全匹配引物，其与T等位基因模板SEQID4匹配，但是在3’末端与A等位基因模板不匹配SEQID1。因此单重PAP扩增了T等位基因模板SEQID4，但是不能扩增A等位基因模板SEQID1。[0021]在连续稀释实验中每20μ1反应体积中基因组模板DNA连续10倍稀释，从IO6份拷贝到10份，测定每个单重PAP的扩增效率均大于96%。[0022]然而，当这两对引物（SEQIDNo2和3,5和6放在同一个反应中扩增两个等位基因模板SEQID1和4中的任一单个或两个时，按照常规设计的单位点双重PAP产生少得多的产物，扩增效率为85-87%，导致在第30个循环结束时产物减少16倍，因此表明引物之间的抑制性相互作用。[0023]在另一个单位点双等位基因多态性Rs4261的实例中，将两对封闭性引物（SEQIDNo8和9，11和12按照常规设计为5’完全匹配引物，其与A和T等位基因匹配（SEQID7和10表1，也观察到了类似的抑制性相互作用，与单重PAP相比，按照常规设计的单位点双重PAP扩增效率每循环下降了约10%。[0024]按照常规设计的5’完全匹配引物导致抑制性相互作用在单位点双重PAP中常见。我们推测，因为多个几乎相同序列的引物与它们的多个几乎相同序列的模板之间的竞争性杂交导致了这种抑制。单位点多重PAP发明的优势[0025]为了扩增位于一个位点上的多个几乎相同序列的模板或等位基因，我们发明了一种新的引物设计，即将人工突变导入阻断性引物的5’区域，以减少抑制性相互作用并增加扩增效率。[0026]表1.使用5’完全匹配引物在单位点双重PAP中的抑制[0027][0029]表1注释[0030]a来源于http:www·ncbi·nlm·nih·govsnp，Rs4261是一个AT单位点双等位基因多态性位点，Rs31224是另一个AT单位点双等位基因多态性位点。[0031]b下游链为模板Rs4261。大写和粗体字母代表了双等位基因之间不同的核苷酸。[0032]。ddA，字母下划线，是位于3’末端作为阻断剂的双脱氧核苷酸。它在Rs4261位点与A等位基因模板匹配，但是其3’末端与T等位基因模板不匹配。发明内容[0033]焦磷酸化激活性聚合反应的多对正向和反向阻断性引物在一个反应中扩增多个模板，其中模板序列位于基因组中的一个位点且包含至少一个核苷酸变异，包括:a用于扩增第一个模板的第一对正向和反向引物，其中选择正向或反向引物，并在其5’区域引入至少一个人工突变;b用于扩增第二模板的第二对正向和反向引物，其中选择与上述第一对引物相同方向的相对应的正向或反向引物，并在其5’区域中引入至少一个人工突变。此外，根据模板序列设计的第一对和第二对引物中的人工突变需位于不同的核苷酸处。在这种情况下，反应中引物之间的抑制性相互作用显著降低。[0034]在这同一个位点上，引物中更进一步包含有第三对正向和反向引物来扩增第三个模板，其中选择与上述第一对引物相同方向的正向或反向引物，并且在其5’区域引入至少一个人工突变。在模板序列中，第一对、第二对和第三对引物中所选的人工突变位于不同的核苷酸位点处。[0035]引物进一步包含:c第一对正向和反向引物，其中选择另一对正向和反向引物，且在其5’区域中引入至少一个人工突变，以及d第二对正向和反向引物，其中选择另一对正向和反向引物，且在其5’区域中引入至少一个人工突变。在模板序列中，第一对和第二对引物中的其他引物所选择的人工突变位于不同的核苷酸处。[0036]对于一对引物，其3’区域，特别是3’末端，与其对应的模板相匹配，但是与其他模板不匹配。[0037]对于一对引物中的一个正向或反向引物，将一个人工突变引入其5’区域。[0038]对于一对引物中的一个正向或反向引物，将二个人工突变引入其5’区域。[0039]引入的人工突变可包括六种类型:A至C，C至A，T至G，G至T，A至T，和T至A。[0040]这六种类型的人工突变导致引物的5’区域与模板的互补链之间的四种类型的人工错配:G-A，C-T，A-A，和T-T。[0041]引入的人工突变可包括四种类型:A至C，C至A，T至G和G至T，其造成引物的5’区域与模板互补链之间的G-A和C-T两种类型的人工错配。[0042]人工突变可包括A到T和T到A两种类型，其导致引物的5’区域与模板的互补链之间的T-T和A-A两种类型的人工错配。[0043]引物的5’区域从5’末端的第一个起至第十二个核苷酸止。[0044]引物的5’区域从5’末端的第三个起至第九个核苷酸止。[0045]正向或反向引物的人工突变在模板序列中的不同核苷酸位点。[0046]引物的5’区域与起始模板互补链之间的人工错配数目是引物中人工突变的数目。[0047]当将一个人工突变引入到每个正向引物或每个反向引物中时，引物的5’区域与复制产生的模板互补链之间的最大人工错配数目是2。[0048]当两个人工突变被引入每个正向引物或每个反向引物时，引物的5’区域与复制产生的模板互补链之间最大人工错配数目是4。[0049]在任何情况下，引物的5’区域与复制产生的模板互补链之间的最小人工错配数目为Oo[0050]各模板序列在单位点中呈完全或部分重叠。[0051]各模板序列在单位点中彼此之间包含至少有一个核苷酸差异。[0052]焦磷酸化激活性聚合反应的方法包括:a提供多对正向和反向阻断性引物以扩增多个模板，而所述模板位于基因组中的一个位点并且彼此之间含有至少一个核苷酸差异，其包含：1用于扩增第一个模板的第一对正向和反向引物，其中所选择的正向或反向引物在其5’区域中引入至少一个人工突变，以及2用于扩增第二模板的第二对正向和反向引物，其中选择与上述第一对引物相同方向的相对应的正向或反向引物，并且在其5’区域中引入至少一个人工突变，b所选择的第一对及第二对引物中的人工突变位于在模板序列中的不同位点，以及c在一个反应中使用多对阻断性引物扩增多个模板。附图说明[0053]本发明通过附图详细阐述本发明的示例性实施例，其中：[0054]图1显示了包含5’人工突变的阻断性引物在EGFR基因的外显子19中的单位点双重PAP中的工作原理。在该实例中，为C0SM6255和⑶SM12369两个模板设计了两对5’人工突变引物SEQIDNo15和16,19和16表2。只图示了正向引物SQEID15和19的5’区域与起始的和复制产生的模板⑶SM6255SEQID13和14的互补链。引物序列中加下划线和大写字母的为人工突变。复制产生的模板序列中有下划线和大写字母的是从引物的5’人工突变通过复制产生的模板上的人工突变。引物的5’区域与模板的互补链之间的不匹配由矩形框表示。右侧为在不同情况下不匹配的数目，指示了不同的互补程度。[0055]图2显示了EGFR基因的19外显子的扩增效率的对比。在A图中，单重PAP使用了一对5’人工突变阻断性引物C0SM6255SEQIDNo15和16来扩增模板C0SM6255SEQID13和14的质粒DNA表2。在B图中，单位点双重PAP同时使用两对引物⑶SM6255和⑶SM12369SEQIDNol5和16，19和16来扩增模板C0SM6255SEQID13和14的质粒DNA。为了确定扩增效率，将每20μ1反应体积中的模板从IO6份拷贝连续10倍稀释至10份，同时也表示了阈值线。X轴是循环数，Y轴是单位的净荧光信号数。通过绘制Ct值与DNA拷贝数的对数曲线，一同确定了单重PAP和单位点双重PAP的扩增效率、线性回归方程、和相关系数R2。[0056]图3显示了5’人工突变阻断性引物在EGFR18基因外显子的单位点多重PAP中的工作原理。在该实例中，为C0M6252，C0SM6253和C0SM6239三个模板设计了共3对5’人工突变引物（SEQID22和23,26和27,30和31表4。只图示了正向引物（SEQID22,26和30的5’区域与C0M6252SEQID20和21的起始的和复制产生的模板的互补链。右侧为在不同情况下不匹配的数目，指示了不同的互补程度。[0057]图4显示了EGFR基因18外显子扩增效率的对比。在A图中，单位点PAP使用了一对5’人工突变阻断性引物C0SM6252SEQID22和23来扩增模板C0SM6252SEQID20和21的质粒DNA表4。在B图中，单位点多重PAP同时使用了三对引物⑶SM6252，C0SM6253和C0SM6239SEQID22和23,26和27,30和31扩增模板⑶SM6252SEQID20和21的质粒DNA0[0058]图5显示了5’人工突变阻断性引物在KRAS基因2外显子的单位点多重PAP中的工作原理。在该实例中，为⑶SM518,⑶SM516和⑶SM517三个模板设计了三对5’人工突变引物SEQID34和35,38和39,42和43表6。图只显示了正向引物（SEQID34,38和42的5’区域与起始的和复制产生的模板COSM518的互补链SEQID32和33。右侧为在不同情况下不匹配的数目，指示了不同的互补程度。[0059]图6显示了KRAS基因2外显子扩增效率的对比。在A图中，单位点PAP使用了一对5’人工突变阻断性引物C0SM518SEQID34和35来扩增模板C0SM518SEQID32和33表6的质粒DNA。在B图中，单位点三重PAP同时使用三对引物⑶SM518，C0SM516和⑶SM517SEQID34和35,38和39,42和43扩增模板C0SM518的质粒DNASEQID32和33。具体实施方式[0060]术语[0061]除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的术语具有相同的含义。[0062]PCR是指聚合酶链式反应。[0063]焦磷酸化反应是指脱氧核糖核酸聚合反应的逆反应。在焦磷酸的存在下，聚合酶可从双链DNA上将3’末端核苷酸去除而生成一个三磷酸核苷酸和一个3’末端去除了这个核苷酸的双链DNA:[dNMP〕n+PPi—[dNMP〕n-l+dNTPDeutscherandKornberg,19690[0064]聚合酶或核酸聚合酶是指具有脱氧核糖核酸聚合或延伸的聚合酶。[0065]3’末端阻断性引物是指一个具有3’末端非延伸型核苷酸3’末端阻断剂）的寡核苷酸，3’末端阻断剂如双脱氧核苷酸或无环核苷酸。这种3’末端非延伸型核苷酸不能被直接延伸，但是它可以通过焦磷酸化被移除，然后由聚合酶延伸未阻断的引物。[0066]PAP是指焦磷酸化激活性聚合反应（Pyrophosphorolysisactivatedpolymerization〇[0067]双向PAPBi-PAP是PAP的一种形式，使用了在3’末端处呈单一核苷酸重叠的一对相反方向的阻断性引物。[0068]指数PAP是PAP的一种形式，用一对相反方向的正向和反向的引物使得指数产物随循环数而指数性累积。至少一个引物是阻断性引物。[0069]灵敏度或检测限定义为当阻断性引物包括3’末端与目标核酸模板匹配时，可检测的最小模板拷贝数。[0070]特异性定义为当阻断性引物例如3’末端与目标核酸模板不匹配时，无法检测的最大模板拷贝数。[0071]选择性，即灵敏度与特异性的比率，被定义为能够在大量不匹配模板拷贝数存在的情况下检测出少量匹配模板拷贝数而不产生假阳性的能力。[0072]热稳定性酶是指具有热稳定或耐热的酶。[0073]TaqFS是与野生型序列相比含有G46E和F667Y氨基酸改变的Taq聚合酶的基因工程形式。[0074]位点LocusorLoci定义为基因组中的核苷酸序列的短区域，例如40bp。[0075]—个位点处的多个模板或等位基因表示至少两个模板位于一个核苷酸序列的短区域。模板之间的序列差异可以少至为一个碱基替代突变、几个碱基的缺失或插入，并且可以接近于同一核苷酸位点处。另外，多个模板或等位基因可能在该区域内完全或部分重叠。[0076]多个几乎相同序列（almost-sequence-identical模板或等位基因意指至少两个模板，通常位于基因组的一个位点，其中序列差异可以少至一个碱基的替代突变，几个碱基缺失或插入。[0077]—对引物是指两个相对应的正向和反向引物。[0078]单重PAP意指在一个反应中用一对引物扩增一个模板。[0079]多重PAP意指在一个反应中同时使用彡2对引物扩增彡2个的模板。[0080]多位点多重PAP是多重PAP的一种形式，即在一个反应中同时使用彡2对的引物在多2个的位点上扩增多2个的模板。[0081]单位点多重PAP是多重PAP的一种形式，即在一个反应中同时使用彡2对的引物在一个位点上扩增多2个模板。[0082]单位点双重PAP意指在一个反应中同时使用2对引物在一个位点上扩增2个的模板。[0083]单位点三重PAP意指在一个反应中同时使用3对引物在一个位点上扩增3个模板。[0084]—个引物的5’区域是引物序列的5’部分，例如从5’末端起始的十个连续的核苷酸。[0085]—个引物的3’区域是引物序列的3’部分，例如从3’末端起始的十个连续的核苷酸。[0086]引物的中间区域是5’区域与3’区域之间的引物序列部分。[0087]5’完全匹配引物：引物5’区域没有人工突变并且与起始模板完全匹配。[0088]5’人工突变引物:将人工突变引入引物的5’区域，导致与起始模板人工错配。[0089]人工突变是指人工引入引物序列的突变，通常在5’区域。[0090]人工错配是指5’人工突变引物与模板之间形成的不匹配。[0091]起始模板是扩增开始前的原始模板，例如来自基因组或质粒DNA的模板。[0092]复制产生的模板是在扩增中从起始模板复制的DNA分子，可以在此后的循环中作为模板。[0093]实时荧光检测的术语[0094]基线是开始的循环期间的荧光信号的水平。低水平可以被认为是反应的背景或“噪音”。[0095]阈值被定义为明显高于基线信号的荧光信号的水平，且可从背景中区分出扩增信号。[0096]Ctthresholdcycle是焚光信号穿过阈值的周期数。[0097]扩增效率被定义为在每一个循环结束时被扩增模板的百分比。[0098]单位点多重PAP的5’人工突变引物的原理[0099]为了使用多对阻断性引物在一个位点上扩增多个几乎相同序列的模板或等位基因而无抑制性相互作用，本发明提供一种新的5’人工突变阻断性引物，其中包含5’区域内的人工突变，如实施例2-4中所述。[0100]a优选四种类型的人工错配[0101]双链短片段DNA的不匹配明显降低了它们的热稳定性，其程度取决于不匹配的类型。总共八种可能的不匹配的热稳定性顺序为:G-TG-GG-AC-TA-A=T-TA-C=C-C不匹配G-T=T-G，G-A=A-G，C-T=T-C和A-C=C-AModrich，1987，Aboul-elaetal.,1985，Ikutaetal·，1987。[0102]我们优选G-A，C-T，A-A和T-T的四种类型的人工错配，因为：1它们的热稳定性顺序为中等程度:它们可以破坏短DNA双链的结构，程度不太少但是也不太多，2它们的热稳定性在顺序上连续排列。而在设计中其他四种类型可能的人工错配G-T，G-G，A-C和C-C不会用到。[0103]b由六种类型的人工突变造成的这四种人工错配[0104]单位点多重PAP要将至少两对阻断性引物应用于至少两个模板，我们在阻断性引物中选择了A到C和C到A，T到G和G到T，A到T和T到A共六种类型的人工突变，导致引物与起始的或复制产生的模板互补链之间产生上述四种类型的人工错配。而其他六种类型可能的人工突变类型A到G和G到A，T到C和C到T，G到C和C到G在设计中根本不会用到。[0105]A到C或C到A的人工突变导致引物与起始的或复制产生的模板互补链之间C-T和A-G人工错配C-T=T-C和A-G=G-A两种类型的人工错配。TiIjG和G到T的人工突变导致引物与起始的或复制产生的模板互补链之间G-A和T-C人工错配G-A=A-G和T-C=C-T两种类型的人工错配。A到T和T到A的人工突变导致引物与起始的或复制产生的模板互补链之间T-T和A-A两种类型的人工错配。因此，单位点多重PAP中总计共有四种类型的人工错配。[0106]c由人工突变引起的人工错配的数量[0107]在模板序列中的不同核苷酸位点设计正向或反向阻断性引物的人工突变时，引物的5’区域与起始的或复制产生的模板互补链之间的人工错配数取决于引物和模板上的人工突变数。在任何情况下，引物的5’区域与复制产生的模板互补链之间的最小人工错配数目为零，例如在实施例2-4中。[0108]d人工错配位置优选位于阻断性引物的5’区域[0109]我们优先选择将人工突变引起的人工错配定位于引物的5’区域，因为：1除了类型之外，不匹配的位置也影响双链短片段0财的热稳定性1〇扣丨^，1987，？丨〇6七1.，2008，2我们发现当不匹配从5’末端的第1至第12个核苷酸即在5’区域内变化时，28-30mer的阻断性引物通常具有大于90%的焦磷酸化以及延伸的效率。然而，当不匹配位于3’区域，尤其是在3’末端时，则焦磷酸化和延伸效率非常低，这导致PAP具高度特异性。[0110]因此人工突变优选位于5’区域，从5’末端起第1个至第12个核苷酸范围内，更优选位于从5’末端算起的第3至9个核苷酸范围内。[0111]e单位点多重PAP中不同阻断性引物与不同模板之间不同人工错配数的机理[0112]在单位点多重PAP反应中，大于等于2对引物可在一个位点上扩增大于等于2个模板。对于一个5’人工突变引物，例如第一对、第二对、和第三对中的每一个正向引物，均在其5’区域中设计了人工突变。5’区域与起始的或复制产生的模板互补链之间的人工错配数目例如从0到4不同，这取决于特定引物与特定模板的匹配。因此，不同引物与不同模板之间的不同的人工错配数提供了减少抑制相互作用的机制：1与其竞争性模板比较，5’人工突变引物的5’区域与其相对应的模板更匹配，具有较少的人工错配数目，2如实施例2-4中那样，模板与其相对应的5’人工突变引物比其竞争性5’人工突变引物更匹配，具有较少的人工错配数目。[0113]例1[0114]材料和方法[0115]引物的制备[0116]IntegratedDNATechnologies公司自3’-5’方向化学合成并用HPLC纯化了3’ddCMP阻断性引物。[0117]通过末端转移酶将寡核苷酸的3’末端添加ddATP，ddTTP和ddGTPLiuandSommer，2000;LiuandSommer，2002，通过酶促合成3’ddAMP，ddTMP和ddGMP阻断性引物。然后用7M尿素16%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。通过UV用260nm吸光度定量回收的引物。[0118]模板的制备[0119]使用Qiagen公司的QIAamp血液微型试剂盒，按照其操作步骤从血液白细胞中提取基因组DNA。通过在pUC57载体中插入化学合成或PCR扩增的100-400bp靶DNA片段构建重组质粒DNA。转化到大肠杆菌中后，根据Qiagen的操作步骤使用QIAamp质粒微型试剂盒提取重组质粒DNA。将洗脱的DNA溶解于TE缓冲液（IOmMTris-HCl，0.1mMEDTA，pH8.0中，用260nmUV吸光度定量。[0120]PAP反应[0121]如无另有说明，20μ1的PAP反应混合物包含有:88mMTris-HCl在25°C下pH8.0，IOmMNH42SO4，1.2-2.5mMMgCl2,25μΜ各种dNTPsdATP，dTTP，dGTP和dCTP，各Ο.ΙμΜ阻断性引物，90μΜNa4PPi，0.IxSybrGreenI染料，1-2单位聚合酶和起始DNA模板。[0122]热循环[0123]使用Bio-RadCFX96实时PCR检测系统定量扩增产物。分析模式：SybrGreen荧光团，基线设置:基线减去曲线拟合，阈值循环数Ct测定:单个阈值，基线方法:SYBR自动计算，阈值设置：自动计算。[0124]热循环需要96°C12秒，60°C30秒，64°C30秒和68°C30秒，共40个循环；或另一个热循环需要96°C12秒，64°C45秒和68°C45秒，共40个循环。在第一个循环之前加入96°C2分钟的变性步骤。[0125]为了确认扩增产物，在68°C至95°C之间进行熔解曲线分析，增量0.5°C并保持5秒以确认特定的扩增产物。[0126]连续稀释实验以确定扩增效率[0127]为了确定扩增效率，将质粒或基因组DNA的模板从每10μ1反应物从IO6份拷贝连续10倍稀释至10份。在实时PAP中，测量每个反应的Ct值，其与在扩增的早期指数阶段中扩增产物的量成正比例。另外，测量熔解温度以确认特定的扩增产物。[0128]然后用对数DNA拷贝数绘制Ct值以便计算线性回归方程，确定相关系数R2和斜率。通过以下公式将斜率转换为扩增效率:效率=10_1#_-1。[0129]例2[0130]单位点双重PAP扩增EGFR基因19外显子[0131]在单位点双重PAP中，设计了两对5’人工突变阻断性引物⑶SM6255和⑶SM12369SEQID15和16，19和16以检测EGFR基因19外显子中的2个碱基缺失性基因突变:一个为18个碱基缺失del2239_2256，C0SM6255SEQID13，另一个为15个碱基缺失del2240_2254，COSMl2369SEQID17表2。[0132]对于第一对C0SM6255的正向引物SEQID15，将两个人工突变导入其5’区域，即从5’末端起计算的第4个核苷酸的T至G人工突变和第7个核苷酸的A至C人工突变。3’末端具有两个核苷酸CddC与模板⑶SM6255SEQID13和14匹配，但是与野生型和其他模板不匹配，具高度特异性。对于第一对的反向引物SEQID16，它由第二对引物共享，没有引入人工突变表2。[0133]对于第二对C0SM12369的正向引物SEQIDN0:19，将两个人工突变导入5’区域，即从5’末端起计算的第3个核苷酸的T到G人工突变，第6个核苷酸的A到C人工突变。3’末端具有两个核苷酸CddT与模板⑶SM12369SEQID17和18匹配，但是与野生型和其他模板表2不匹配，具高度特异性。[0134]图1显示了5’人工突变引物在两对阻断性引物⑶SM6255和C0SM12369SEQIDNo15和16，19和16中的工作原理。仅图示了正向引物的5’区域（SEQID15和19以及C0SM6255SEQID13和14的起始的和复制产生的模板的互补链。人工错配的数目变化从零到4,这取决于特定引物与模板之间的组合情况，显示了如何减少引物之间的抑制相互作用的机制。[0135]表3描述了更复杂的情况。并非如图1所示的扩增一个模板，而是在一个反应中用两对引物⑶SM6255和C0SM12369SEQIDNo15和16，19和16扩增两个模板〇11625和：05]\112369SEQIDNO13和14,17和18。仅显示了正向5’人工突变引物（SEQID15和19的5’区域及C0M625和C0SM12369SEQIDN0:13和14，17和18的起始的和复制产生的模板的互补链。图示了5’区域与模板互补链之间人工错配的数目和类型，再次表明了如此机制：1在5’区域，对与相竞争的模板而言，5’人工突变引物与其相对应的模板更加匹配，具有较少的人工错配数目，2在5’区域，对与相竞争的5’人工突变引物而言，模板与其相对应的5’人工突变引物更加匹配，具有较少的人工错配数目。[0136]在单位点双重PAP使用两对阻断性引物⑶SM6255和⑶SM12369SEQIDNo15和16，19和16单独或一起扩增两个模板⑶SM6255和C0SM12369SEQID13和14，17和18图2，表2。作为比较，单重PAP使用了一对引物来扩增其相应的模板。[0137]为了确定扩增效率，将每20μ1反应体积内的起始模板从IO6份拷贝连续10倍稀释至10份（图2,表2。没有观察到抑制性相互作用，在扩增相同的模板时单重PAP和单位点双重PAP之间的效率差异〈5%。[0138]例3[0139]单位点三重PAP扩增EGFR基因18外显子[0140]在单位点三重PAP中，针对EGFR基因18外显子3个基因突变设计了三对5’人工突变阻断性引物C0SM6252，C0SM6253和C0SM6239SEQID22和23,26和27,30和31表4。[0141]将人工突变引入每个引物的5’区域表4。例如，第一对C0SM6252的正向引物SEQID22，从5’末端起第五个核苷酸处引入A至C人工突变。对于第二对⑶SM6253的正向引物SEQID26，从5’末端起第7个核苷酸引入T至G人工突变。对于第三对C0SM6239的正向引物SEQID30，从5’末端起第7个核苷酸引入T至G人工突变。[0142]图3和表5显示了5’人工突变引物是如何在三对阻断性引物C0SM6252，C0SM6253和C0SM6239SEQID22和23,26和27,30和31中工作的。只图示了正向引物（SEQID22,26和30的5’区域与相应的起始的和复制产生的模板的互补链。5’区域与模板互补链之间的人工错配数目的变化为从零到2，这取决于特定引物与模板之间的组合情况并表明了机理。[0143]另外，第一对引物⑶SM6252SEQID22和23的3’末端对含有EGFR基因18外显子的c.2155GA的模板⑶SM6252SEQID20和21是特异的，但是与野生型及其他模板不匹配，具高度特异性。第二对引物⑶SM6253SEQID26和27的3’末端对含有c.2155GT的模板⑶SM6253SEQID24和25是特异的，但是与野生型及其他模板不匹配。第三对引物C0SM6239SEQID30和31的3’末端对含有c.2156GC的模板C0SM6239SEQID28和29是特异的，但是与野生型和其他模板不匹配。[0144]单位点三重PAP单独或同时一起使用了三对阻断性引物⑶SM6252，C0SM6253和⑶SM6239SEQID22和23,26和27,30和31扩增三个模板⑶SM6252SEQID20和21，C0SM6253SEQID24和25和C0SM6239SEQID28和29图4,表4。单重PAP使用一对引物来扩增其相应的模板作为比较。[0145]通过起始模板的10倍连续稀释，确定了单重PAP和单位点三重PAP的扩增效率（图4,表4。在EGFR基因18外显子的单位点三重PAP中使用了5’人工突变引物，没有观察到抑制性相互作用。[0146]例4[0147]单位点三重PAP扩增KRAS基因2外显子[0148]在单位点三重PAP中，针对KRAS基因2外显子的3个基因突变设计了三对5’人工突变封闭性引物C0SM518，C0SM516和C0SM517SEQID34和35,38和39,42和43表6。[0149]将人工突变引入每一引物的5’区域表6。例如，第一对⑶SM518的正向引物SEQID34为从5’末端起第五个核苷酸处引入A至C人工突变。第二对C0SM516的正向引物（SEQID38为从5’末端起第七个核苷酸处引入A至C人工突变.第三对⑶SM517的正向引物（SEQIDN0:42，为从5’末端起第9个核苷酸处被引入A至C人工突变。[0150]图5和表7显示了三对阻断性引物C0SM518，C0SM516和C0SM517SEQID34和35,38和39,42和43的5’人工突变引入的人工错配是如何工作的。只图示了正向引物的5’区域SEQID34,38和42与相对应的起始的和复制产生的模板的互补链。5’区域与模板的互补链之间的人工错配数目的变化为从零到2,这取决于特定引物与模板之间的组合情况并显示了作用机理。[0151]第一对引物⑶SM518SEQID34和35的3’末端对于KRAS基因的2外显子中含有c.34GC突变的模板C0SM518SEQID32和33是特异的，但是与野生型和其他模板不匹配，具有高度的特异性。第二对引物C0SM516SEQID38和39的3’末端对含有c.34GT突变的模板⑶SM516SEQID36和37是特异的，但是与野生型和其他模板不匹配。第三对引物C0SM517SEQID42和43的3’末端对含有c.34GA突变的模板C0SM517SEQID40和41是特异的，但是与野生型和其他模板不匹配。[0152]单位点三重PAP单独或同时使用三对阻断性引物C0SM518，C0SM516和C0SM517SEQID34和35,38和39,42和43来扩增三个模板⑶SM518SEQID32和33，⑶SM516SEQID36和37和C0SM517SEQID40和41图6,表6。单重PAP使用一对引物来扩增其相应的模板作为比较。[0153]通过起始模板的10倍连续稀释，确定单重PAP和单位点三重PAP的扩增效率（图6，表6。在KRAS基因2外显子的单位点三重PAP中使用了5’人工突变引物，没有观察到抑制性相互作用。[0154]参考文献[0155]Aboul-elaF,KohD1TinocoI,Jr.,MartinFH.I985.Base-basemismatches.ThermodynamicsofdoublehelixformationfordCA3XA3G+dCT3YT3GX,Y=A,C,G,T.NucleicAcidsRes1313:4811-24.[0156]DeutscherMP1KornbergA.1969.Enzymaticsynthesisofdeoxyribonucleicacid.28.Thepyrophosphateexchangeandpyrophosphorolysisreactionsofdeoxyribonucleicacidpolymerase.JBiolChem24411:3019-28.[0157]IkutaS,TakagiK1WallaceRB,ItakuraK.1987.Dissociationkineticsof19basepairedoligonucleotide-DNAduplexescontainingdifferentsinglemismatchedbasepairs.NucleicAcidsResl52:797-811.[0158]LiuQ,NguyenVQjLiX,SommerSS.2006.Multiplexdosagepyrophosphorolysis-activatedpolymerization:applicationtothedetectionofheterozygousdeletions.Biotechniques405:661-8.[0159]LiuQ，SommerSS.2000.Pyrophosphorolysis-activatedpolymerizationPAP:applicationtoallele-specificamplification.Biotechniques295:1072-1080.[0160]LiuQjSommerSS.2002.PyrophosphoroIysis-activatabIeoligonucleotidesmayfacilitatedetectionofrarealleles,mutationscanningandanalysisofchromatinstructures.NucleicAcidsRes302:598-604.[0161]LiuQ,SommerSS.2004a.Detectionofextremelyrareallelesbybidirectionalpyrophosphorolysis-activatedpolymerizationallele-specificampIificationBi-PAP-A:measurementofmutationloadinmammaliantissues.Biotechniques36I:156-66.[0162]LiuQ，SommerSS.2004b.PAP:detectionofultrararemutationsdependsonP^oligonucleotides:’’sleepingbeauties’’awakenedbythekissofpyrophosphorolysis.HumMutat235:426-36.[0163]LiuQ，SommerSS.2004c.PyrophosphorolysisbyTypeIIDNApolymerases:implicationsforpyrophosphorolysis-activatedpolymerization.AnalBiochem324I:22-8.[0164]ModrichP.1987.DNAmismatchcorrection.AnnuRevBiochem56:435-66.[0165]PiaoXjSunLjZhangTjGanYjGuanY.2008.Effectsofmismatchesandinsertionsondiscriminationaccuracyofnucleicacidprobes.ActaBiochimPol554:713-20·[0166]表2.EGFR基因19外显子单位点双重PAP的5’人工突变引物[0167][0168]表2注释：[0169]a来自http:www·sanger·ac·ukgeneticsCGPcosmic[0170]bEGFR基因19外显子中，C0SM6255为del2239_2256缺失性基因突变，COSM12369为del2240_2254缺失性基因突变。[0171]5又显示了模板的下游链。对于复制产生的模板，两个大写，粗体和下划线的字母为从5’人工突变引物复制的相应人工突变，可以在后面的循环中作为模板。[0172]d正向引物是一个5’人工突变引物，其中两个人工突变G和C被表示为粗体和下划线字母。另外，带下划线的CddC在3’末端是对C0SM6255模板特异的两个核苷酸，但是与野生型序列不匹配。。[0173]e反向引物用于两对引物，并且该引物不引入人工突变。[0174]£显示引物5’末端人工突变的类型和位置。[0175]g在单重PAP中，第一对引物在第一个反应中扩增第一模板，第二对引物在第二个反应中扩增第二模板以确定它们的扩增效率。[0176]h在单位点双重PAP中，同时使用两对引物分别在第一个反应中扩增第一模板，在第二个反应中扩增第二模板。[0177]4广增相同的模板，如果单重PAP和单位点双重PAP之间的效率差异彡5%，则称为是抑制，如〈5%则为无抑制。0.2%是单重PAP和单位点双重PAP之间的效率差异。[0178]表3.EGFR基因19外显子单位点双重PAP5’人工突变引物的5’区域与模板之间人工错配数和类型[0179][0180]表3注释：[0181]a单位点双重PAP仅考虑正向5’人工突变引物的5’区域与起始的和复制产生的模板的互补链。[0182]^4nt处T到G，第7nt处A到C是指在5’末端的第4个核苷酸处的T到G人工突变和从5’末端到第7个核苷酸的A到C的两个人工突变，均在正向5’人工突变引物C0SM6255的5’区域中。[0183]。2意味着人工突变导致的两个人工错配。例如，正向5’人工突变引物C0SM6255的5’区域与起始模板C0SM6255的互补链之间形成G-A人工错配。人工错配是从引物的5’末端计算起第4个核苷酸。[0184]表4.EGFR基因18外显子单位点三重PAP的5’人工突变引物[0185][0186]表4注释：[0187]aEGFR基因18外显子中，C0SM6252含有c.2155GA基因突变，C0SM6253含有c.2155GT基因突变，并且⑶SM6239含有c.2156GC基因突变。三个突变位于序列中的两个相邻核苷酸处。[0188]b在单重PAP中，第一对引物在第一个反应中扩增第一模板，第二对引物在第二个反应中扩增第二模板，第三对引物在第三个反应中扩增第三模板以确定它们的扩增效率。[0189]e在单位点三重PAP中，同时使用三对引物分别在第一个反应中扩增第一模板，在第二个反应中扩增第二模板，在第三个反应中扩增第三模板。[0190]表5.EGFR基因18外显子单位点三重PAP5’人工突变引物的5’区域与模板之间的人工错配数和类型a[0191][0192]表5注释：[0193]a单位位点三重PAP使用三对引物⑶SM6252，C0SM6253和⑶SM6239SEQID22和23,26和27,30和31在同一个反应内扩增三个模板C0SM6252SEQID20和21，⑶SM6253SEQIDNO:ID24和25和C0SM6239SEQID28和29。[0194]bS管两个正向引物的两个人工突变位于从其5’末端计算在相同位置，但是其定位于模板序列的不同核苷酸处。[0195]表6.KRAS基因2外显子单位点三重PAP5’人工突变引物[0196][0197]表6注释：[0198]aKRAS基因2外显子中C0SM518含有c.34GC基因突变，C0SM516含有c.34GT基因突变，C0SM517含有c.34GA基因突变。三个突变位于序列中的两个相邻核苷酸处。[0199]b在单重PAP中第一对引物在第一反应中扩增第一模板，第二对引物在第二反应中扩增第二模板，第三对引物在第三个反应中扩增第三模板以确定它们的放大效率。[0200]e在单位点三重PAP中，同时使用三对引物在第一个反应中扩增第一模板，在第二个反应中扩增第二模板，在第三个反应中扩增第三模板。[0201]表7.KRAS基因2外显子单位点三重PAP5’人工突变引物的5’区域与模板之间人工错配数和类型a[0202][0203]表7注释：[0204]a单位点三重PAP使用三对引物C0SM518，C0SM516和C0SM517SEQID34和35,38和39,42和43扩增三个模板⑶SM518SEQID32和33，C0SM516ID36和37和⑶SM517SEQID40和41。

权利要求：1.焦磷酸化激活性聚合反应使用多对正向和反向阻断性引物在一个反应中扩增多个模板，其特征在于所述模板序列位于基因组的一个位点并且彼此间具有至少一个核苷酸的差异，包括：a用于扩增第一模板的第一对正向和反向引物，其中选择正向引物或反向引物，并在其5’区域中引入至少一个人工突变，和b用于扩增第二模板的第二对正向和反向引物，其中选择与上述第一对引物相同方向的相对应的正向或反向引物，并在其5’区域中引入至少一个人工突变，其中在模板序列中，所选第一对和第二对引物的人工突变位于不同的核苷酸处，由此可显著降低反应中引物之间的抑制性相互作用。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于所述引物还包括一个第三对正向和反向引物用于扩增第三模板，其中选择与上述第一对引物相同方向的正向或反向引物，并且在其5’区域引入至少一个人工突变;其中在模板序列中，第一对，第二对和第三对引物中所选的人工突变位于模板序列中不同的核苷酸处。3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于所述引物进一步包括：c第一对正向和反向引物，其中选择另一对正向和反向引物，且在其5’区域中引入至少一个人工突变，以及d第二对正向和反向引物，其中选择另一对正向和反向引物，且在其5’区域中引入至少一个人工突变，其中在模板序列中，第一对和第二对引物中的其他引物所选的人工突变位于不同的核苷酸处。4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于第一对引物的3’区域与第一模板匹配，第二对引物的3’区域与第二模板匹配。5.根据权利要求1所述的引物，其特征在于在正向或反向引物的5’区域引入一个人工突变。6.根据权利要求1所述的引物，其特征在于在正向或反向引物的5’区域引入两个人工突变。7.根据权利要求1所述的引物，其特征在于所述人工突变包含A到C，C到A，T到G，G到T，A至IjT和T到A的六种类型。8.根据权利要求1所述的引物，其特征在于所述人工突变导致引物的5’区域与所述模板互补链之间形成G-A，C-T，A-A，及T-T四种类型的人工错配。9.根据权利要求1所述的引物，其特征在于人工突变包括A至C，C至A，T至G和G至T四种类型的突变，导致在引物5’区域与所述模板互补链之间形成G-A和C-T两种类型的人工错配。10.根据权利要求1所述的引物，其特征在于人工突变包含A至T和T至A两种类型，导致引物的5’区域与所述模板互补链之间形成T-T和A-A两种类型的人工错配。11.根据权利要求1所述的引物，其特征在于引物的5’区域范围为5’末端第一个至第十二个核苷酸。12.根据权利要求1所述的引物，其特征在于引物的5’区域范围为5’末端第三个至第九个核苷酸。13.根据权利要求1所述的引物，其特征在于正向或反向引物的人工突变在所述模板序列中的不同核苷酸处。14.根据权利要求1所述的引物，其特征在于各模板序列呈完全或部分重叠。15.根据权利要求1所述的引物，其特征在于各模板序列彼此至少含有一个核苷酸差异。16.根据权利要求1所述的引物，其特征在于当将一个人工突变引入到每个引物中时，引物的5’区域与复制产生的模板互补链之间的最大人工错配数目是2。17.根据权利要求1所述的引物，其特征在于当将2个人工突变引入到每个引物中时，弓丨物的5’区域与复制产生的模板互补链之间的最大人工错配数目是4。18.根据权利要求1所述的引物，其特征在于引物的5’区域与复制产生的模板互补链之间的最小人工错配数为零。19.一种焦磷酸化激活性聚合反应的方法，包括：a提供了多对正向和反向阻断性引物以扩增多个模板，其中所述模板序列位于基因组的同一个位点并且彼此之间含有至少一个核苷酸差异，包括：1用于扩增第一模板的第一对正向和反向引物，其中选择正向或反向引物，并在其5’区域引入至少一个人工突变，以及2用于扩增第二模板的第二对正向和反向引物，其中选择与上述第一对引物相同方向的相对应的正向或反向引物，并且在其5’区域引入至少一个人工突变，其中在模板序列中，所选第一对和第二对引物的人工突变位于不同的核苷酸处，和b在一个反应中扩增模板。

百度查询： 丁少峰 刘强 多重焦磷酸化激活性聚合反应在一个反应内扩增单位点多个序列几乎完全相同的模板