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申请/专利权人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所

摘要：本发明公开了一种狗尾草响应不同干旱及盐胁迫表达的荧光定量内参基因Actin及其应用。本发明的应用扩增得到的ActinPCR产物大小适中，容易判定：狗尾草基因组响应不同干旱及盐胁迫条件下的基因表达内标基因肌动蛋白基因PCR扩增片段长度为315bp，既可以与PCR引物二聚体明显区分开，容易判定，扩增片段又不会太长，对PCR反应酶没有特别要求。

主权项：1.一种狗尾草肌动蛋白基因Actin作为内参基因在狗尾草响应不同干旱及盐胁迫表达的荧光定量PCR中的应用，其中，所述肌动蛋白基因Actin的基因登录号为Sevir.9G114100。

全文数据：狗尾草响应不同干旱及盐胁迫表达的荧光定量内参基因Actin及其应用技术领域本发明涉及荧光定量PCR检测领域，具体地指一种狗尾草响应不同干旱及盐胁迫表达的荧光定量内参基因Actin及其应用。背景技术狗尾草Setariaviridis属单子叶植物纲禾本科黍亚科，黍亚科常分布在热带和亚热带地区，高粱、甘蔗、玉米、谷子、薏苡、黄茅、白茅等都属于黍亚科，该科植物具有热带植物的典型特征。狗尾草是新型的转基因模式植物，与双子叶模式植物拟南芥相比均具有生长周期短、身材矮小、易于种植、容易转化、基因组小、二倍体、能产生大量自交系种子等优点，是优良的单子叶模式植物。有研究人员以狗尾草为模式植物，通过NMU诱变，筛选到了一个花絮稀疏的突变体。通过BSA重测序方法，鉴定到了突变基因。有意思的是，玉米中的同源基因突变后也表现出与狗尾草突变体相同的表型。这一研究，证明了以狗尾草为模式植物进行玉米基因组功能研究的可行性。研究植物基因的表达情况是植物分子生物学领域的研究热点，荧光定量PCRqRT-PCR技术已成为研究基因表达量的重要方法，当研究植物基因的表达时需要选一个高度保守并且表达稳定的基因作为内参。由于常用的内参基因存在不稳定性，因此根据具体的实验条件筛选稳定合适的内参基因极为重要。目前，尚未有文献报道应用于研究狗尾草响应不同干旱及盐胁迫基因表达的内参基因。发明内容本发明所要解决的技术问题就是一种狗尾草响应不同干旱及盐胁迫表达的荧光定量内参基因Actin及其应用，本发明在狗尾草8个Actin基因中筛选了一个表达最稳定的内参基因，该基因能够用于后续狗尾草响应不同干旱及盐胁迫基因表达的验证工作；方便之后进行基因表达分析时更有利于得到精确可靠的结果；为深入研究狗尾草功能基因奠定分子基础。为实现上述目的，本发明提供的一种狗尾草响应不同干旱及盐胁迫表达的荧光定量内参基因Actin，所述内参基因Actin的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.7所示。上述肌动蛋白基因Actin编码的肌动蛋白是真核生物中真核生物细胞中一种普遍存在的组成型表达的看家基因，它参与细胞分裂、形态的维持、信号传导、细胞器运动等多种重要生理活动，除了有基因序列高度保守的特征外，还具有mRNA表达数量高，数量稳定等特性。是用于基因表达分析的理想内参基因。进一步地，所述内参基因Actin的特异性引物的核苷酸序列为：Actin-F：CTTCCAGCCATCTTTCATT；Actin-R：CCAGACTCGTCGTACTCAG。本发明还提供了一种上述的内参基因Actin在狗尾草响应不同干旱及盐胁迫表达的荧光定量PCR中的应用。进一步地，所述应用的方法为：提取不同干旱及盐胁迫处理的狗尾草的RNA，采用内参基因Actin的特异性引物进行荧光定量PCR。再进一步地，上述荧光定量PCR的反应体系和扩增条件如下：1Actin荧光定量PCR反应体系：SYBRPremixExTaq2×12.5μL，RoxreferenceDyeⅡ50×0.5μL，引物Actin-F10pM和Actin-R10pM各1μL，cDNA模板1.0μL，ddH2O9.0μL反应体系总体积为25μL。2Actin荧光定量PCR扩增条件：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸35s，共40个循环。其中，所述的狗尾草基因组内标基因肌动蛋白基因荧光定量PCR预期扩增片段长度为315bp。本发明的有益效果在于：1、本发明应用扩增ActinPCR产物大小适中，容易判定：狗尾草基因组响应不同干旱及盐胁迫条件下的基因表达内标基因肌动蛋白基因PCR扩增片段长度为315bp，既可以与PCR引物二聚体明显区分开，容易判定，扩增片段又不会太长，对PCR反应酶没有特别要求。2、Actin特异性强：PCR扩增片段只有一个，没有非特异扩增，表明设计的Actin荧光定量PCR引物特异性强，保证了目的片段的扩增效率。附图说明图1狗尾草8个肌动蛋白基因实时荧光定量PCR扩增片段电泳分析，图中，1：Sevir.3G070600；2：Sevir.3G232400；3：Sevir.5G398400；4：Sevir.5G470300；5：Sevir.7G305900；6：Sevir.8G042300；7：Sevir.9G114100；8：Sevir.9G194900；9：阴性对照；图2狗尾草8个肌动蛋白基因实时荧光定量PCR扩增曲线，图中，A-H图分别对应登录号为Sevir.3G070600、Sevir.3G232400、Sevir.5G398400、Sevir.5G470300、Sevir.7G305900、Sevir.8G042300、Sevir.9G114100和Sevir.9G194900的肌动蛋白基因实时荧光定量PCR扩增曲线；图3狗尾草8个肌动蛋白基因实时荧光定量PCR溶解曲线，图中，A-H图分别对应登录号为Sevir.3G070600、Sevir.3G232400、Sevir.5G398400、Sevir.5G470300、Sevir.7G305900、Sevir.8G042300、Sevir.9G114100和Sevir.9G194900的肌动蛋白基因实时荧光定量PCR溶解曲线图4狗尾草响应不同干旱及盐胁迫时肌动蛋白基因实时荧光定量PCR扩增片段电泳分析，图中，M：DNA分子标准DL2000；泳道1-9依次为:以未作任何处理的狗尾草、100mmolL甘露醇处理的狗尾草、200mmolL甘露醇处理的狗尾草、300mmolL甘露醇处理的狗尾草、400mmolL甘露醇处理的狗尾草、40mmolL氯化钠处理的狗尾草、80mmolL氯化钠处理的狗尾草、120mmolL氯化钠处理的狗尾草和160mmolL氯化钠处理的狗尾草为模板，登录号为Sevir.9G114100的肌动蛋白基因实时荧光定量PCR扩增片段电泳分析；图5狗尾草响应不同干旱及盐胁迫时肌动蛋白基因实时荧光定量PCR溶解曲线，图中，曲线表示以未作任何处理的狗尾草、100mmolL甘露醇处理的狗尾草、200mmolL甘露醇处理的狗尾草、300mmolL甘露醇处理的狗尾草、400mmolL甘露醇处理的狗尾草、40mmolL氯化钠处理的狗尾草、80mmolL氯化钠处理的狗尾草、120mmolL氯化钠处理的狗尾草和160mmolL氯化钠处理的狗尾草为模板，登录号为Sevir.9G114100的肌动蛋白基因实时荧光定量PCR溶解曲线；图6狗尾草响应不同干旱及盐胁迫时RNA-SEQ筛选基因实时荧光定量PCR验证，图中，A和B代表通过RNA-SEQ筛选的需要验证的目的基因；Sample1-Sample9对应的cDNA模板依次为未作任何处理的狗尾草、100mmolL甘露醇处理的狗尾草、200mmolL甘露醇处理的狗尾草、300mmolL甘露醇处理的狗尾草、400mmolL甘露醇处理的狗尾草、40mmolL氯化钠处理的狗尾草、80mmolL氯化钠处理的狗尾草、120mmolL氯化钠处理的狗尾草、160mmolL氯化钠处理的狗尾草。具体实施方式为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。实施例1狗尾草响应不同干旱及盐胁迫最稳定表达的内参基因的筛选1候选内参基因序列的获得：选取狗尾草共8个肌动蛋白基因作为内参基因的候选基因；2引物设计：根据获得的候选基因序列设计该基因相应的特异引物表1；表1狗尾草8个肌动蛋白基因荧光定量PCR引物3PCR模板的准备：收集未作任何处理的狗尾草样品后，用植物总RNA提取试剂盒Foregene提取样品总RNA，然后用cDNA反转试剂盒ReverseTranscriptaseM-MLV，Takara按照说明书反转cDNA的第一链，作为荧光定量PCR的模板；4荧光定量PCR反应体系：SYBRPremixExTaq2×12.5μL，RoxreferenceDyeⅡ50×0.5μL，引物Actin-F10pM和Actin-R10pM各1μL，cDNA模板1.0μL，ddH2O9.0μL反应体系总体积为25μL；5Actin荧光定量PCR扩增条件：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸35s，共40个循环；6肌动蛋白基因Actin的PCR产物电泳检测与产物特异性和通用性验证用狗尾草8个肌动蛋白基因，根据各自的引物表1分别进行荧光定量PCR验证，PCR扩增片段电泳分析如图1所示，从图中可以看出5-8号泳道条带单一且清晰，并且片段大小与预期一致。从电泳结果可以看出5-8号泳道对应的基因更适宜做荧光定量的内标基因。从狗尾草8个肌动蛋白基因实时荧光定量PCR扩增曲线图2中可以看出：4，5和7号泳道对应的基因如图2D，2E和2G中CT值较低，所谓Ct值，就是最先出现超过阈值信号的那个循环数。或者说是到了第几个循环才出现超过阈值的信号。C代表的是cycle，循环数目，T代表的是threshold阈值。所以表达量越少的话，需要越多的循环才能扩增出来。也就是CT值越高。因此，4，5和7号泳道对应的基因更适宜做荧光定量的内标基因。从狗尾草8个肌动蛋白基因实时荧光定量PCR的溶解曲线图3中可以看出1，3，4，6，7，8号基因对应的图3A，3C，3D，3F，3G和3H溶解曲线均为单峰，说明其对应的引物的特异性强。其中峰值高则说明PCR扩增效率好，从图3G中可以看出7号基因Sevir.9G114100对应的溶解曲线峰值单一，曲线平滑且峰值最高。综上所述，登录号Sevir.9G114100对应的Actin基因是8个Actin基因中最合适的内标基因。实施例2狗尾草响应不同干旱及盐胁迫时内标基因Actin的适用性验证：1候选内参基因序列的获得：选取狗尾草登录号为Sevir.9G114100的肌动蛋白基因作为内参基因的候选基因；2引物设计：根据获得的候选基因序列设计该基因相应的特异引物表1，编号7；3PCR模板的准备：收集不同浓度干旱及盐胁迫处理后的狗尾草样品后，用植物总RNA提取试剂盒Foregene提取样品总RNA，然后用cDNA反转试剂盒ReverseTranscriptaseM-MLV，Takara按照说明书反转cDNA的第一链，作为荧光定量PCR的模板；4荧光定量PCR反应体系：SYBRPremixExTaq2×12.5μL，RoxreferenceDyeⅡ50×0.5μL，引物Actin-F10pM和Actin-R10pM各1μL，cDNA模板1.0μL，ddH2O9.0μL反应体系总体积为25μL；5Actin荧光定量PCR扩增条件：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸35s，共40个循环；6肌动蛋白基因Actin的PCR产物电泳检测与产物特异性和通用性验证在实施例1中可以看出，登录号Sevir.9G114100对应的Actin基因是8个Actin基因中最合适的内标基因。为了进一步验证该基因在狗尾草响应不同程度干旱及盐胁迫时的表达稳定性，做了该基因在9个不同处理条件下的分析检测。用肌动蛋白基因ActinSevir.9G114100的PCR引物对9个不同处理条件下的狗尾草进行PCR检测，结果发现肌动蛋白基因Actin的引物在PCR扩增时只扩增出一个条带并且在不同程度干旱及盐胁迫处理条件下的狗尾草均能扩增出同一条带，大小在315bp位置，与预期PCR片段长度315bp一致，符合基因组内标基因特异性和通用性原则如图4所示。对实时荧光定量PCR溶解曲线的分析实质上是产物的特异性分析。如果溶解曲线为单峰则说明引物的特异性强，峰值高则说明PCR扩增效率好。肌动蛋白基因ActinSevir.9G114100在响应不同程度干旱及盐胁迫时的实时荧光定量PCR溶解曲线均为单峰图5，且与其它7个Actin图3相比峰值均较高，说明引物特异性强，PCR扩增效率好。从上述实时荧光定量PCR引物扩增条带、实时荧光定量PCR溶解曲线分析结果可以看出，肌动蛋白基因ActinSevir.9G114100具备作为狗尾草基因组响应不同干旱及盐胁迫条件下的基因表达内标基因的特点，利用本发明所述PCR引物序列及扩增方法可以实现对狗尾草响应不同干旱及盐胁迫条件下目的基因的相对表达量的检测。7狗尾草响应不同干旱及盐胁迫时RNA-SEQ筛选基因结果验证为了验证所选内标的实用性，我们对狗尾草响应不同干旱及盐胁迫时的RNA-SEQ结果所筛选到的目的基因任选2个进行9种不同处理条件下的实时荧光定量PCR验证，结果如图6A，6B所示，验证的结果与RNA-SEQ结果保持一致。证明所选的Actin内标基因适用于狗尾草响应不同干旱及盐胁迫时的基因表达验证工作。其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

权利要求：1.一种狗尾草响应不同干旱及盐胁迫表达的荧光定量内参基因Actin，其特征在于：所述内参基因Actin的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.7所示。2.根据权利要求1所述狗尾草响应不同干旱及盐胁迫表达的荧光定量内参基因Actin，其特征在于：所述内参基因Actin的特异性引物的核苷酸序列为：Actin-F：CTTCCAGCCATCTTTCATT；Actin-R：CCAGACTCGTCGTACTCAG。3.一种权利要求1所述的内参基因Actin在狗尾草响应不同干旱及盐胁迫表达的荧光定量PCR中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用的方法为：提取不同干旱及盐胁迫处理的狗尾草的RNA，采用内参基因Actin的特异性引物进行荧光定量PCR。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述荧光定量PCR的反应体系和扩增条件如下：1Actin荧光定量PCR反应体系：反应体系总体积为25μL。2Actin荧光定量PCR扩增条件：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸35s，共40个循环；其中，所述的狗尾草基因组内标基因肌动蛋白基因荧光定量PCR预期扩增片段长度为315bp。

百度查询： 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 狗尾草响应不同干旱及盐胁迫表达的荧光定量内参基因Actin及其应用