买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：青岛国际旅行卫生保健中心(青岛海关口岸门诊部)

摘要：本发明涉及一种物种鉴定领域，是一种以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒及其鉴定方法，其特点是根据三带喙库蚊COIII基因序列设计特异性引物，利用优化的高分辨率熔解曲线反应体系鉴定三带喙库蚊各种形态如成虫、卵、幼虫和蛹等。能对三带喙库蚊进行鉴定，操作简单、速度快、PCR产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异、真正实现闭管操作。

主权项：1.一种以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊COIII基因鉴定方法，其特征是，包括如下步骤：1）高分辨率熔解曲线模板三带喙库蚊基因组DNA的制备使用电动匀浆器低温研磨三带喙库蚊组织；使用TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0试剂盒，参照试剂盒说明提取三带喙库蚊基因组DNA；2）高分辨率熔解曲线反应体系：30μL反应体系包括：FastStartTaqDNA聚合酶0.5μL，DNA模板2μL，dNTP混合液2μL，ResoLight饱和荧光染料1μL，COIII-F引物1μL，COIII-R引物1μL，反应缓冲液3μL，25mMMgCl23.6μL，ddH2O15.9μL；COIII-F和COIII-R序列如下：COIII-F：5’-CGATGAGGAATAATTTTATT-3’；COIII-R：5’-CAGTAAAGAATAAACTTTGAG-3’；3）高分辨率熔解曲线反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min；PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线，95℃变性1min，40℃降温1min，65-95℃连续升温，每次升温1℃，收集25个荧光信号；40℃冷却10s，使用LightCycler®480GeneScanningSoftware软件分析高分辨率熔解曲线；横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度，其中有波动的曲线为三带喙库蚊，直线的曲线为对照蚊种。

全文数据：以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒及其鉴定方法技术领域本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒及其鉴定方法。背景技术口岸蚊类种群鉴定主要手段为形态学鉴定，依靠有形态学鉴定经验和蚊类形态鉴定能力的口岸检验检疫人员，根据医学蚊类分类检索表进行鉴定。然而，形态学鉴定面临很多问题：蚊类专业鉴定人才少，人员培养周期长；鉴定人员的经验程度、专业水平、蚊类完整性与发育阶段等因素可导致鉴定周期长，效率低；一些复杂的种群如近缘种群和同形种群难以鉴定；对于蚊类卵、幼虫和蛹，为获取其可靠鉴定特征，经常需要蚊类人工培养后鉴定；口岸送检蚊类若数量较大，对口岸蚊类鉴定工作是非常大的考验；等等。因而，口岸蚊类鉴定除了提高检疫人员鉴定能力和研发鉴定辅助系统外，仍需要发展安全、快速、准确、灵敏的鉴定方法，以实现蚊类快速鉴定。近年来，随着分子生物学技术的发展，常规PCR、限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、单链构象多态性（SSCP）、DNA条形码技术等分子手段已经应用于蚊类种群鉴定。然而，这些鉴定方法均有不足之处：常规检测特异PCR产物序列，依赖于较贵的分子探针或产物测序；RFLP鉴定蚊种不仅耗时，而且需要大量样本；RAPD鉴定蚊种快速，但结果不稳定，且有时不可重复；SSCP只能作为检测蚊类基因突变的方法，要确定突变的位置和类型，需进一步测序，且电泳条件要求比较严格；DNA条形码技术的后续测序工作耗时、耗经费。鉴于上述方法的不足，为了安全、快速、准确、灵敏的实现蚊类种群的分子鉴定，需要探寻新的分子鉴定手段。发明内容针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒及其鉴定方法可作为三带喙库蚊新的鉴别手段，它以单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线为基础进行蚊类鉴定，操作简单、速度快、低成本、高通量、结果准确、不受检测位点的局限、PCR产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异等优势，实现真正的闭管操作从而降低污染风险，非常适合大量样品的分析。本发明是由以下技术方案来实现的：本发明设计了一组以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊特异性鉴定引物，序列如下：COIII-F：5’-CGATGAGGAATAATTTTATT-3’COIII-R：5’-CAGTAAAGAATAAACTTTGAG-3’。利用上述的检测引物，本发明提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒，它包括如成分：1）三带喙库蚊COIII基因的特异性引物COIII-F：5’-CGATGAGGAATAATTTTATT-3’COIII-R：5’-CAGTAAAGAATAAACTTTGAG-3’。2）PCR混合液：FastStartTaqDNA聚合酶，反应缓冲液，dNTP混合液，ResoLight饱和荧光染料；3）三带喙库蚊基因组；4）ddH2O；5）25mMMgCl2。本发明还提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊方法，包括如下步骤：1）高分辨率熔解曲线模板三带喙库蚊基因组DNA的制备使用电动匀浆器低温研磨三带喙库蚊组织；使用TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0试剂盒TaKaRa公司，参照试剂盒说明提取三带喙库蚊基因组DNA；2）高分辨率熔解曲线反应体系：30μL反应体系包括：FastStartTaqDNA聚合酶0.5μL，DNA模板2μL，dNTP混合液2μL，ResoLight饱和荧光染料1μL，COIII-F引物1μL，COIII-R引物1μL，反应缓冲液3μL，25mMMgCl23.6μL，ddH2O15.9μL。4）高分辨率熔解曲线反应程序：94℃预变性5min。94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。72℃延伸5min。PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线。95℃变性1min。40℃降温1min。65-95℃连续升温（每次升温1℃，收集25个荧光信号）。40℃冷却10s。使用LightCycler®480GeneScanningSoftware软件分析高分辨率熔解曲线。本发明的一种以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒及操作方法，根据三带喙库蚊COIII基因序列设计特异性引物，可对三带喙库蚊的成虫、卵、幼虫和蛹进行鉴别，与现有鉴别手段相比，本发明的有益效果在于：1）可对三带喙库蚊的各种状态进行鉴别，如成虫、卵、幼虫和蛹等状态，不需要孵化后鉴别。2）本发明设计的引物，灵敏度高，特异性强。3）操作简单、速度快，当天即可出具结果。4）PCR产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异等优势，实现真正的闭管操作从而降低污染风险，非常适合大量样品的分析。附图说明图1：三带喙库蚊和其他对照蚊种以及阴性对照的COIIIPCR结果图，图中，从左到右依次是DL2000、三带喙库蚊、淡色库蚊、致倦库蚊、白纹伊蚊、埃及伊蚊、刺扰伊蚊、骚扰阿蚊、背点伊蚊、凶小库蚊、阴性对照。图2：三带喙库蚊和其他对照蚊种以及阴性对照的高分辨率熔解曲线图。横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。具体实施方式实施例1本实施例提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒，包括如下体系：1）三带喙库蚊COIII基因的特异性引物COIII-F：5’-CGATGAGGAATAATTTTATT-3’COIII-R：5’-CAGTAAAGAATAAACTTTGAG-3’。2）PCR混合液：FastStartTaqDNA聚合酶，反应缓冲液，dNTP混合液，ResoLight饱和荧光染料；3）三带喙库蚊基因组；4）ddH2O；5）25mMMgCl2。实施例2本实施例提供了一种以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定方法，按如下的步骤进行：1）使用电动匀浆器低温研磨三带喙库蚊组织。使用TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0试剂盒TaKaRa公司，参照试剂盒说明提取三带喙库蚊基因组DNA。2）30μL高分辨率熔解曲线反应体系包括：FastStartTaqDNA聚合酶0.5μL，DNA模板2μL，dNTP混合液2μL，ResoLight饱和荧光染料1μL，COIII-F引物1μL，COIII-R引物1μL，反应缓冲液3μL，25mMMgCl23.6μL，ddH2O15.9μL。3）高分辨率熔解曲线反应程序：94℃预变性5min。94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。72℃延伸5min。PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线。95℃变性1min。40℃降温1min。65-95℃连续升温（每次升温1℃，收集25个荧光信号）。40℃冷却10s。使用LightCycler®480GeneScanningSoftware软件分析高分辨率熔解曲线。4）结果：三带喙库蚊COIIIPCR扩增出条带，对照蚊种未扩增出条带，基因测序并用NCBIBlast比对，比对结果为三带喙库蚊。利用LightCycler®480GeneScanningSoftware软件分析高分辨率熔解曲线，明确了了三带喙库蚊的扩增曲线。5）结论：本发明首次利用高分辨熔解曲线特异性鉴定三带喙库蚊，拓展了蚊类鉴定的视角。本发明利用基于三带喙库蚊COIII基因的高分辨熔解曲线也是蚊种鉴定的一个新方向。本试剂盒操作简单、速度快、PCR产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异、真正实现闭管操作，可对三带喙库蚊的各种状态进行鉴别，如成虫、卵、幼虫和蛹等状态，不需要孵化后鉴别。当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。序列表山东国际旅行卫生保健中心以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒及其鉴定方法2SIPOSequenceListing1.0120DNA人工序列ArtificialSequence1cgatgaggaataattttatt20221DNA人工序列ArtificialSequence2cagtaaagaataaactttgag21

权利要求：1.以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定特异性引物，其特征是，序列如下：COIII-F：5’-CGATGAGGAATAATTTTATT-3’；COIII-R：5’-CAGTAAAGAATAAACTTTGAG-3’。2.以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒，其特征是，它包括如下成分：1）三带喙库蚊COIII基因的特异性引物COIII-F：5’-CGATGAGGAATAATTTTATT-3’COIII-R：5’-CAGTAAAGAATAAACTTTGAG-3’。2）PCR混合液：FastStartTaqDNA聚合酶，反应缓冲液，dNTP混合液，ResoLight饱和荧光染料；3）三带喙库蚊基因组；4）ddH2O；5）25mMMgCl2。3.一种以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定方法，其特征是，它包括如下步骤：1）高分辨率熔解曲线模板三带喙库蚊基因组DNA的制备使用电动匀浆器低温研磨三带喙库蚊组织；使用TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0试剂盒TaKaRa公司，参照试剂盒说明提取三带喙库蚊基因组DNA；2）高分辨率熔解曲线反应体系：30μL反应体系包括：FastStartTaqDNA聚合酶0.5μL，DNA模板2μL，dNTP混合液2μL，ResoLight饱和荧光染料1μL，COIII-F引物1μL，COIII-R引物1μL，反应缓冲液3μL，25mMMgCl23.6μL，ddH2O15.9μL。4）高分辨率熔解曲线反应程序：94℃预变性5min。94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。72℃延伸5min；PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线，95℃变性1min，40℃降温1min，65-95℃连续升温（每次升温1℃，收集25个荧光信号），40℃冷却10s，使用LightCycler®480GeneScanningSoftware软件分析高分辨率熔解曲线。

百度查询： 青岛国际旅行卫生保健中心(青岛海关口岸门诊部) 以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒及其鉴定方法