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申请/专利权人：内蒙古农业大学
摘要：本发明提供一种高效的利用蓝斑筛选的基因敲除方法，首先构建插入基因lacZ和目的基因上下同源臂的质粒，将重组质粒转化入目标菌株的感受态细胞进行一次筛选和二次筛选，挑选在含有X‑gal和蔗糖的LB平板上生长且变蓝色，且在含卡那霉素的LB抗性平板上不生长的单菌落，所得单菌落经PCR验证正确即为成功敲除目的基因的目的菌株。与现有同源重组技术相比，本发明从敲除菌株的初次筛选到二次筛选通过蓝斑表型筛选有效提高了筛选概率。当要选择在蔗糖平板上生长而在卡那霉素平板上未生长的单菌落进行验证时，本发明通常在对点50个以内单菌落即可获得阳性菌株。
主权项：1.一种高效的利用蓝斑筛选的基因敲除方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：1构建插入基因lacZ和目的基因上下同源臂的质粒，所得质粒转化入大肠杆菌DH5α，然后涂布于含有生色底物X-gal和50μgmL卡那霉素的LB抗性平板上，并对平板上的蓝色单菌落提取质粒进行PCR验证；2将PCR验证的阳性转化子进行划线纯化，选择紫外分光光度计下A260A2801.8且A260A2302.0的重组质粒；3将所得重组质粒转化入目标菌株的感受态细胞中，然后涂布于含有X-gal和25μgmL卡那霉素的LB抗性平板，进行一次筛选；所述目标菌株的基因组中不含完整的β-半乳糖苷酶基因lacZ；4所述一次筛选中得到的蓝色转化子接种于含25μgmL卡那霉素的LB抗性液体培养基进行活化，再将菌液划线于含有X-gal和25μgmL卡那霉素的LB抗性平板，进行纯化；5挑取步骤4得到的蓝色单菌落于LB无抗液体培养基，将菌液稀释至浓度为10-4，然后涂布于含有X-gal和质量浓度20％蔗糖的LB平板不含NaCl进行二次筛选，直至得到蓝色单菌落；6所得蓝色单菌落分别在含有X-gal和质量浓度20％蔗糖的LB平板不含NaCl与含有25μgmL卡那霉素的LB抗性平板上进行对点培养；7挑选在步骤6的含有X-gal和质量浓度20％蔗糖的LB平板上生长且变蓝色，且在含有25μgmL卡那霉素的LB抗性平板上不生长的单菌落，所得单菌落经基因组PCR验证正确即为成功敲除目的基因的目的菌株。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 内蒙古农业大学 一种高效的利用蓝斑筛选的基因敲除方法
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