买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：郑州大学

摘要：本发明提供一种AnnexinV‑FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及提取方法，主要包括以下步骤：1表达和纯化AnnexinV，制备AnnexinV‑FITC，构建AnnexinV‑FITC外泌体捕获亲和磁珠；2细胞培养上清液分离与浓缩：细胞培养后分离出细胞培养上清液，并经浓缩处理；3外泌体提取：将步骤2所得细胞培养上清液与外泌体捕获亲和磁珠共孵育，得到亲和磁珠‑外泌体复合物；4外泌体洗脱，将得到的亲和磁珠‑外泌体复合物与洗脱液共孵育，收集洗脱液，即为所提取分离的外泌体产物。本发明所述外泌体捕获亲和磁珠可重复使用，提取方便，且提取得到的外泌体纯度高。

主权项：1.利用AnnexinV-FITC外泌体捕获亲和磁珠提取外泌体的方法，其特征在于，步骤如下：步骤3-1：外泌体提取：于生物体液中加入外泌体结合增强剂和AnnexinV-FITC外泌体捕获亲和磁珠，混合均匀后，4℃、50rpm旋转孵育2h；步骤3-2：清洗：将步骤3-1旋转孵育后的混合液置于磁力架上1min，弃上清液，然后再将亲和磁珠分散于洗涤缓冲液内混匀，再将混匀后的混合液置于磁力架上1min，弃上清液，由此得到清洗后的亲和磁珠-外泌体复合物；步骤3-3：外泌体洗脱：于步骤3-2所得亲和磁珠-外泌体复合物中加入洗脱缓冲液，孵育5min后，置于磁力架上1min，收集上清液，该上清液即为所提取分离的外泌体产物；步骤3-1中，所述外泌体结合增强剂为CaSO4浓度为2mM-150mM的CaSO4水溶液；步骤3-2中，所述洗涤缓冲液为含有如下浓度的组分的水溶液：2mM-150mMCaSO4，10-100mMNaH2PO4和50-500mMNaCl，且所述洗涤缓冲液中还含有重量百分比为0.01-0.1％的吐温20；步骤3-3中，所述洗脱缓冲液为含有如下浓度的组分的水溶液：2mM-150mMEDTA，10-100mMNaH2PO4和50-500mMNaCl；所述AnnexinV-FITC外泌体捕获亲和磁珠的制备方法，包括以下步骤：步骤1-1：AnnexinV原核表达：将已构建好的带有His标签的pET-28b-AnnexinV质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21DE3中，得到BL21DE3-pET-28b-AnnexinV菌株，35-39℃且100-220rpm培养至OD值0.6-0.9，加入IPTG使体系中IPTG的终浓度为0.5-1mM，18-25℃过夜诱导表达；步骤1-2：蛋白提取：收集诱导表达后的菌体，加入PBS重悬菌体，冰浴条件下超声破碎0.5-2h，然后进行4℃，12000g离心20-60min，收集上清液，并使用0.45μm水系滤膜进行抽滤，收集滤液备用；步骤1-3：蛋白纯化：将步骤1-2收集的滤液与Ni-NTA亲和层析柱共孵育，再用不同浓度的咪唑缓冲液洗脱，收集并检测得到含有目的蛋白的洗脱液，使用10KDa超滤管进行浓缩，即得AnnexinV浓缩液；步骤1-4：将AnnexinV浓缩液加入3.0-20.0kDa分子量截留的透析袋中，在50-120mM的NaHCO3溶液或50-120mM的Na2HPO3溶液中搅拌，2-15℃过夜透析，得到AnnexinV透析液；步骤1-5：将步骤1-4得到的AnnexinV透析液稀释为0.5-5mgmL，并将稀释后的AnnexinV透析液与0.5-5mgmL的FITC溶液按照100-150：1的体积比混匀，2-15℃且30-100rpm旋转孵育2-10h得到混合液；步骤1-6：将步骤1-5得到的混合液加入到3.0-20.0kDa分子量截留的透析袋中，并在PBS缓冲液中2-15℃过夜搅拌透析；步骤1-7：收集步骤1-6透析后得到的AnnexinV-FITC溶液，使用MonoQ离子交换柱进行纯化得到AnnexinV-FITC复合物；步骤1-8：亲和磁珠制备：将抗FITC抗体磁珠与步骤1-7得到的AnnexinV-FITC复合物混合，2-15℃且30-100rpm旋转孵育2-10h，即得到外泌体捕获亲和磁珠；所述抗FITC抗体磁珠为超顺磁四氧化三铁磁珠。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 郑州大学 Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法