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申请/专利权人：青岛市市立医院

摘要：本发明涉及生物信息技术领域，具体涉及一种高表达miR‑146a‑5p的外泌体抑制THP‑1分化和巨噬细胞M1极化的方法，具体包括以下步骤：S1、高表达miR‑146a‑5p外泌体的制备；S2、外泌体的鉴定；S3、细胞的培养；S4、外泌体miR‑146a‑5p与THP‑1或巨噬细胞共孵育；S5、实验结果的分析，本发明中通过化学转染的方法制备了肝细胞来源的高表达miR‑146a‑5p的外泌体探究其对THP‑1分化和巨噬细胞M1极化的作用，且化学转染的方法获得的外泌体完整性好，肝细胞来源的外泌体携带的遗传信息物质更容易被肝细胞吸收。

主权项：1.一种非治疗目的的高表达miR-146a-5p的外泌体抑制THP-1分化和巨噬细胞M1极化的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、高表达miR-146a-5p外泌体的制备，具体为：1将HepG2细胞接种在10cm细胞培养皿中，细胞生长12h后，使用RiboFECTTMCPReagent分别将50nmolLmiR-146a-5pmimic或阴性对照转染至HepG2细胞中，转染48h后收集细胞培养基上清进行外泌体制备；2对细胞培养基以300g和2000g转速进行分次离心20min以消除大的死亡细胞和细胞碎片，每次离心完成后去掉沉淀，保留上清进行下一次离心；然后将得到的上清以20000g转速离心30min以去除较大的微囊泡；然后将得到的上清液以100,000g转度离心70min以收集外泌体沉淀，用6mlPBS清洗外泌体沉淀一次，100,000g转度离心70min得到高表达miR-146a-5p的外泌体和对照组外泌体；S2、外泌体的鉴定，具体为：1取20μl提取完成的外泌体溶液，通过透射电子显微镜镜下观察并拍照记录外泌体的形态；2取20μl提取完成的外泌体悬液至新的1.5ml的EP管，加入20μlRIPA,裂解充分后，按4:1的比例加入5×SDS溶液，置于100℃水浴中煮沸5min，收取蛋白样品进行电泳，检测外泌体标记蛋白CD63的表达情况；3从外泌体中分离总RNA,将miRNA逆转录为cDNA，以U6为内参，定量miR-146a-5p的表达；S3、细胞的培养：HepG2在添加10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，THP-1在含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养，两种细胞均在37℃，5％CO2培养箱中进行培养；然后向悬浮培养的THP-1细胞中加入PMA至终浓度为100ngml以诱导THP-1分化为巨噬细胞；S4、外泌体miR-146a-5p与THP-1或巨噬细胞共孵育：将高表达miR-146a-5p的外泌体或对照组外泌体加入至THP-1或THP-1分化的巨噬细胞中共孵育48h；以U6为内参，定量THP-1和巨噬细胞内miR-146a-5p的表达；以18S为内参,定量巨噬细胞内MCP-1、TNF-a、IL-6的表达；收集细胞样品于1.5mLEP管中，RIPA裂解充分后，以4:1加入5×SDS，获取蛋白样品,电泳完后，检测THP-1细胞内CD68和巨噬细胞内CD86的表达情况；S5、实验结果的分析。

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