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申请/专利权人：福州大学

摘要：本发明公开一种检测FEN1酶活性的SERS传感器及其制备方法和应用。所述SERS传感器包括金盘温控电极HAuE，磁珠MB，皮瓣内切酶FEN1，带皮瓣的DNA双链S1S2S3，核酸外切酶ExoIII，基底探针H1，引发探针triDNA，信号探针S4、信号分子4‑MBA和MCH修饰在金纳米立方块表面的SERStag。通过提高HAuE的表面温度，FEN1活性显着增加，从而导致引发探针triDNA的快速产生。在ExoIII辅助扩增过程中，triDNA与MBH1结合后产生大量的MBsssDNA，MBsssDNA与SERStag结合，从而测得SERS信号。SERS强度与FEN1的活性呈正相关，即实现对FEN1活性的高灵敏检测。

主权项：1.一种检测FEN1酶活性的SERS传感器的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）SERStag的制备将5μL10μM的信号探针S4用5μL10mM的TCEP活化1h，得到活化后的信号探针S4；向活化后的信号探针S4中加入25μLAuNCs溶液和165μL0.01%SDS，37℃孵育12h；孵育结束后，每隔0.5h添加5μL2M的NaCl、共添加两次，而后37℃孵育过夜；加入2μL2mM的4-MBA乙醇溶液，继续孵育1小时；加入1.5μL2mM的MCH，继续孵育2h；孵育结束后，3000rpm离心3次、每次10min，收集沉淀重新分散于75μLTrisBuffer2中，得到SERStag溶液并在4℃储存；（2）FEN1活性检测温控金盘电极HAuE用Al2O3粉抛光，然后分别用乙醇和超纯水超声清洗，浸入0.5M的H2SO4溶液中进行电化学清洗，最后用超纯水清洗并用氮气吹干，得到活化后的HAuE电极；将5μL10μM的寡核苷酸链S1、5μL10μM的寡核苷酸链S2、5μL10μM的寡核苷酸链S3的混合物加热至95℃并保持5min，缓慢冷却至37℃，而后用5μL含0.4MNaCl且浓度为10mM的TCEP于黑暗条件下活化1h，得到comDNA溶液；将10μLcomDNA溶液滴加到活化后的HAuE电极表面，室温孵育1h，再用TrisBuffer1冲洗后置于氮气中干燥，得到HAuEcomDNA电极；将HAuEcomDNA电极浸入2mM的MCH中封闭30min，得到HAuEcomDNAMCH电极；将HAuEcomDNAMCH电极浸入含有FEN1酶的FEN1反应缓冲液中，用直流电加热电极在57℃孵育2h，再转移到离心管中80℃灭活20min，得到含有triDNA的溶液并在4℃储存；将100μL1mgmL的链霉亲和素修饰的磁珠用TrisBuffer3洗涤后分散在85μLTrisBuffer3中，加入15μL10μM的基底探针H1，37℃孵育2h，再用TrisBuffer3洗涤后分散在60μLTrisBuffer3中，得到MBH1组件；将30μL含有triDNA的溶液与15μLMBH1组件、5μL10×NEBuffer和1μL15UμL的ExoIII酶混合，37℃孵育2h，得到MBsssDNA组件；将51μLMBsssDNA组件用TrisBuffer3洗涤后分散在25μLTrisBuffer3中后，再与75μLSERStag溶液混合，37℃孵育6h，得到MBssDNAMCH4-MBAS4AuNC组件；通过磁铁将51μLMBssDNAMCH4-MBAS4AuNC组件用Trisbuffer3洗涤6次后浓缩至2.5μL，滴在硅片上，45℃干燥后进行SERS检测；其中，所述信号探针S4序列为：5'-SH-CH26-TTTTTTTTTCACTCGTG-3'，所述寡核苷酸链S1序列为：5'-AAAAAGCGTGTCATTCCTGTCCGATGCTCGTCATTGCATCGTGAAGGG-3'，所述寡核苷酸链S2序列为：5'-TGATCCTTGATCCTTAGTAGATGC-3'，所述寡核苷酸链S3序列为：5'-SH-TTTTTTTTTTCCCTTCACGATGCAATGACGCATCTACTAAGGATCAAGGATCA-3'，所述triDNA序列为：5'-AAAAAGAGTGTCATTCCTGTCCGATGCTC-3'，所述基底探针H1序列为：5'-biotin-TTTTTTCACGAGTGTCATTCCCTGCATCGGACAGGAATGACACTCTTTTT-3'。

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