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申请/专利权人：中国科学院深圳先进技术研究院

摘要：本发明公开一种杆状病毒‑rAAV生产系统中转移载体pAAV‑Donor的制备方法及应用，制备方法包括：突变去除AAVCap基因表达框中的IIS型限制酶识别位点；修饰获得的AAVCap基因表达框；制备AAV‑Core、AAV‑Cap和AAV‑Rep骨架质粒；将经修饰的Cap基因表达框、异源功能性基因表达元件、经修饰的AAVRep基因表达框依次插入至AAV‑Cap、AAV‑Core、AAV‑Rep骨架质粒的多克隆位点中，得到pAAV‑Rep、pAAV‑Cap和pAAV‑Core；将三个质粒通过Goldengate克隆技术一步组装，转化Stbl3感受态细胞，筛选阳性克隆，即得pAAV‑Donor。

主权项：1.一种杆状病毒-rAAV生产系统中转移载体pAAV-Donor的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1突变去除AAVCap基因表达框中的IIS型限制酶识别位点；2修饰步骤1中获得的AAVCap基因表达框：所述修饰的方式选自1-4中的一种或几种：1在VP1ATG起始密码子5’端插入额外框外起始密码子；2将VP1的ATG起始密码子更换为次优翻译起始密码子、突变VP3亚基表达框外VP1表达框内的ATG密码子；3在AAV衣壳编码序列的非ATG翻译起始密码子与编码氨基酸残基的密码子之间插入一个或多个氨基酸残基的编码序列；4插入内含子剪接受体序列调控VP1、VP2、VP3的相对表达；修饰AAVRep基因表达框：所述修饰的方式选自1-2中的一种：1突变Rep78起始密码子与Rep52起始密码子之间所有的ATG序列、更换Rep78基因的起始密码子为非ATG序列；2插入内含子剪接受体序列弱化Rep78蛋白的表达；3分别制备AAV-Core、AAV-Cap和AAV-Rep骨架质粒；所述AAV-Core骨架质粒属于Goldengate组装供体质粒，包含两个相同类型的IIS型限制性内切酶位点、两个AAV-ITR序列；所述AAV-Cap骨架质粒属于Goldengate组装供体质粒，包含两个与所述AAV-Core骨架质粒相同的IIS型限制性内切酶位点、杆状病毒启动子、转录和转录后调控序列；所述AAV-Rep骨架质粒属于Goldengate组装受体质粒，包含两个与所述AAV-Cap骨架质粒相同的IIS型限制性内切酶位点、杆状病毒启动子、转录和转录后调控序列、负筛选标记基因、Tn7转座元件；4将步骤2中获得的经修饰的Cap基因表达框插入至步骤3AAV-Cap骨架质粒的多克隆位点中，将异源功能性基因表达元件插入至步骤3AAV-Core骨架质粒的多克隆位点中，将步骤2中获得的经修饰的AAVRep基因表达框插入步骤3AAV-Rep骨架质粒的多克隆位点中，得到pAAV-Rep、pAAV-Cap和pAAV-Core；5将步骤4中获得的三个质粒通过Goldengate克隆技术一步组装，转化Stbl3感受态细胞，筛选阳性克隆，即可获得转移载体pAAV-Donor。

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