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申请/专利权人：西湖维泰(杭州)诊断技术有限公司

摘要：本发明首次提供了一种红细胞中叶酸衍生物及相关代谢辅酶的检测及前处理方法，解决了现有技术中检测步骤繁琐、检测结果不准的问题；对红细胞清洗液的成分进行了深入研究，发现了葡萄糖可以维持红细胞内部叶酸衍生物的稳定性的机理，且不会影响对叶酸相关代谢辅酶的检测；对红细胞裂解液的成分进行了深入研究，发现了抗坏血酸和十二烷基硫酸钠具有保护红细胞裂解释放的叶酸衍生物及其相关代谢辅酶的效果，提升了各检测指标的回收率；提供了一种全新的去蛋白液，一方面能够提高各指标的回收率，另一方面能避免叶酸相关代谢辅酶与蛋白产生共沉淀；改进了流动相和液相分离梯度，使得B2和B6的定量限同时达到最低，得到的色谱图峰型好，定量更精确。

主权项：1.一种红细胞中叶酸衍生物及其相关代谢辅酶的检测方法，其特征在于，检测方法包括前处理方法，前处理方法包括步骤：S1红细胞清洗：取去除血浆的红细胞样本，加入红细胞清洗液，混匀，离心，去除上层红细胞清洗液；S2红细胞裂解：向完成步骤S1后的红细胞样本中加入红细胞裂解液，混匀，酶解；S3去除蛋白：向完成步骤S2后的红细胞样本中加入去蛋白液，混匀，离心，取上清液待测；所述叶酸衍生物及其相关代谢辅酶为四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5,10-次甲基四氢叶酸、叶酸相关代谢辅酶VB2、叶酸相关代谢辅酶VB3和叶酸相关代谢辅酶VB6；步骤S2中的红细胞裂解液为含有20UulGGH酶、0.2%十二烷基硫酸钠、1%抗坏血酸的水溶液；步骤S1中的红细胞清洗液含有55mM葡萄糖；步骤S3中的去蛋白液为甲醇、乙腈、25%三氯乙酸水溶液的混合液，甲醇、乙腈、25%三氯乙酸水溶液的体积比为4:3:3；检测方法还包括液相色谱串联质谱检测；液相色谱串联质谱检测的流动相A是含有10mM乙酸铵和0.7%甲酸的水溶液；流动相B是甲醇、乙腈的混合液，甲醇、乙腈的体积比为8:2；液相色谱串联质谱检测的液相梯度为：时间为0分钟时，流动相B体积百分比为5%；时间为0.5分钟时，流动相B体积百分比为30%；时间为1分钟时，流动相B体积百分比为30%；时间为2分钟时，流动相B体积百分比为95%；时间为3分钟时，流动相B体积百分比为95%；时间为3.1分钟时，流动相B体积百分比为5%；时间为4.5分钟时，流动相B体积百分比为5%。

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