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申请/专利权人：上海博满生物科技有限公司

摘要：一种直扩ERA偶联CRISPRcas12a的核酸一步实时检测方法，将DNA或RNA样品加入裂解液，室温下，剧烈混匀5‑10秒，静置1‑3分钟取上清液，即可完成模板的制备；配制一步法反应体系，将CRISPRcas12a基因编辑系统直接加入ERA反应体系，通过直扩ERA体系偶联CRISPRcas12a基因编辑系统，在同一反应体系下使EPA扩增反应和CRISPRCas12a反式切割作用进行偶联，利用cas12a蛋白的反式切割活性，进行一步法反应，降低了气溶胶污染，实现靶标DNA或者RNA快速精准检测，反应结果通过荧光可视化实时呈现，可定性、定量检测，减少了劳动强度，缩短检测时间。

主权项：1.一种非疾病诊断目的的金黄色葡萄球菌的直扩ERA偶联CRISPRcas12a核酸一步实时检测方法，包括以下步骤：1设计引物选取金黄色葡萄球菌的靶基因，GenBankID：CP049528.1，其扩增长度为174bp，具体核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，根据选取的靶基因设计相应的引物，获得上游引物ERA-SAU-F、下游引物ERA-SAU-R、SAU-crRNA和ssDNA-FQ；所述ssDNA-FQ的具体序列为：FAM-5’-TTTTTT-3’-TAMRA；2制备模板将待测金黄色葡萄球菌的DNA样品加入裂解液，室温下，剧烈混匀5-10秒，静置1-3分钟，取上清液，即可完成模板的制备；其中，所述裂解液中含有终浓度为0.45-0.55M的NaOH和9.5-10mM的Na2EDTA；3扩增反应将步骤2制备的模板加入ERA-Cas12a反应体系中，37℃保温50-60min，完成DNA的扩增反应；其中，所述ERA-Cas12a反应体系中包括：上游引物ERA-SAU-F0.1-0.3μM、下游引物ERA-SAU-R0.1-0.3μM、SAU-crRNA15.6-62.5nM、ssDNA-FQ25-100nM、Lbcas12a25-100nM和激活剂280mMMgOAc2溶液；4荧光实时检测在步骤3的扩增反应过程中，每分钟收集1次检测荧光值时，λex＝493nm，λem＝522nm，荧光值，先制作标准样品浓度-最大荧光值标准曲线，再根据获得的标准曲线计算待测样品浓度；步骤1中设计的引物从5’到3’，具体核苷酸序列如下：ERA-SAU-F:5’-CAGCTCCACAGAGTACAGATGCAAGTAATAAAG-3’；ERA-SAU-R:5’-CTCCAGAGTCAATACCAACTGTCACATTCGTCA-3’；SAU-crRNA:5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUUUAGCGGCUGUAGCUGCA-3’。

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