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申请/专利权人：皖南医学院第一附属医院(皖南医学院弋矶山医院)

摘要：本发明公开了一种基于TCR单链可变区的靶向肿瘤新抗原RASG12V的嵌合抗原受体记忆NK细胞的研制及其应用。所述的嵌合抗原受体包括单链TCR的可变区、铰链区、跨膜区、共刺激结构域、信号传导结构域，必要时，可串联分选标签。所述NK细胞为记忆NK细胞。所述TCR的可变区包括具有α链可变区的Vα片段和具有β链可变区的Vβ片段，所述Vα片段的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，所述Vβ片段的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本发明构建的嵌合抗原受体具有TCR的靶点优势，能够识别肿瘤新抗原。而NK细胞缺乏完整的CD3信号通路，通过CAR的信号通路，再与记忆NK细胞结合，可以有效性解决TCR‑T、CAR‑T、CAR‑NK、TCR‑NK的局限性。同时嵌合抗原受体记忆NK细胞能在体内持续存活，在抗原再次刺激时，能够产生更强大的杀伤作用，在防止肿瘤复发方面起到一定的作用。是一种靶点范围广、通用性强、安全、有效且低成本的细胞治疗产品。

主权项：1.一种基于TCR单链可变区的靶向RASG12V的嵌合抗原受体记忆NK细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体记忆NK细胞可由如下方法制备：S1、分离出NK细胞，并在细胞因子刺激下被激活；S2、激活后的NK细胞通过一定的方式除去激活物，并更换成新鲜的培养基；S3、用带有嵌合抗原受体基因的慢病毒感染激活后的NK细胞；S4、感染后的NK细胞在24小时后更换成新鲜的培养基；S5、加入辐照的滋养层细胞继续培养；S6、收获细胞；其中，所述嵌合抗原记忆NK细胞包含基于TCR单链可变区的靶向RAS-G12V的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体依次包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激结构域、信号传导结构域，其中抗原结合结构域为TCR单链抗体的可变区，具有α链可变区的Vα片段和β链可变区的Vβ片段，所述Vα片段的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，所述Vβ片段的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；所述NK细胞来自于健康成人脐带血提取的NK细胞、外周血提取的NK细胞或市售的胚胎干细胞或诱导多能干细胞产生的NK细胞；所述α链可变区的Vα片段和β链可变区的Vβ片段是通过linker连接，其连接顺序为Vα-linker-Vβ；所述嵌合抗原受体可选的包括分选标签；所述铰链区为CD8α，如SEQIDNO：10所示；所述跨膜区为NKG2D，如SEQIDNO：11所示；所述信号传导结构域为CD3ζ结构域，如SEQIDNO：12所示；所述共刺激结构域为4-1BB，如SEQIDNO：13所示。

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