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申请/专利权人：武汉铂安诺生物科技有限公司

摘要：本发明涉微生物检测技术领域，特别涉及基于纳米孔靶向测序血液常见病原体快速检测方法，包括以下步骤：S1、选择血液的30中感染病原微生物其包括细菌、真菌和病菌；S2、收集检测方案中的微生物全部基因组，在其特异性区域设计批量多重PCR引物；S3、筛选覆盖度高、特异性高的引物，进行引物合成；S4、先进行血液样本前处理。本发明所述的基于纳米孔靶向测序血液常见病原体快速检测方法，提升了病原微生物特异性，解决传统检测技术使用通用引物检测无法精准区分物种的问题；提升了检测灵敏度；降低实验周期短；减少了试剂、设备的使用和人员配备成本，从而降低检测成本。

主权项：1.基于纳米孔靶向测序血液常见病原体快速检测方法，包括以下步骤：S1、选择血液的30中感染病原微生物其包括细菌、真菌和病菌，具体的微生物分类表格如下： S2、收集检测方案中的微生物全部基因组，在其特异性区域设计批量多重PCR引物；S3、筛选覆盖度高、特异性高的引物，进行引物合成；S4、先进行血液样本前处理；S5、然后进行核酸提取并进行质控；S6、多重PCR靶向扩增，后进行产物纯化；S7、生信数据分析：纳米孔测序的原始FAST5格式数据通过dorado软件进行处理，以识别碱基并分离条形码，从而为每个样本生成相应的FASTQ文件，随后，利用minimap2软件，将这些FASTQ数据与特定的基因标记序列进行匹配，其命令格式为“minimap2-axmap-ont-t5target.gene.sequence.fastabarcode*.fastqbarcode*.sam”，最终，通过Python语言中的pysam库，对匹配结果进行分析，统计出每个物种的测序序列数量，以实现30种微生物的检测；S8、报告解读：由于检测范围为30种微生物，通过生信分析计算得出微生物的初始质控阳性阈值为以reads作为数据量评判标准值，Reads-高通量测序平台所产生的原始序列称为reads，检出数据量是指在属种水平上检测到的该微生物的严格比对的序列数目：细菌检出阳性阈值：15reads真菌检出阳性阈值：10reads病毒检出阳性阈值：5reads由于血液样本为混合物，并不是纯物质，那么阳性判断阈值需要根据对血液样本检测结果进行病原体感染情况的分析和判断，同时要将考虑整体测序数据的质控和序列整体的分布情况：1当样本的整体测序序列数据totalreads≥200且病原微生物测序序列数据Purereads≥51015时，检测结果判定为阳性；2当样本的整体测序序列数据totalreads≥200但生信流程过滤数据占比超过35-40％或病原微生物测序序列数据Purereads＜51015时，检测结果可信度不高；可判定为阴性。3当样本的整体测序序列数据totalreads＜200时，判定实验失败，需要重新实验。

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