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申请/专利权人：西北农林科技大学
摘要：本发明公开了一种通过基因编辑ClSPO11‑2创制二倍体无籽西瓜的方法，属于植物基因工程育种技术领域。本发明公开的一种通过基因编辑ClSPO11‑2创制二倍体无籽西瓜的方法，首次利用CRISPRCas9技术，对西瓜ClSPO11‑2基因进行靶向编辑，减数分裂无法配对联会，雌雄配子不育，使其基因功能缺失，双受精后种子败育，从而在二倍体水平创制无籽西瓜。通过本方法创制的二倍体无籽西瓜编辑植株与野生型材料相比，除了雌雄配子不育，营养生长阶段表型均无发生明显变化，无籽表型可以通过Clspo11‑2ClSPO11‑2杂合编辑的植株无限繁殖。该方法具有简单易操作、效率高、成本低和周期短等优点。
主权项：1.一种通过基因编辑ClSPO11-2创制二倍体无籽西瓜的方法，其特征在于，具体步骤如下：1根据5’-UTR区和ClSPO11-2CDS序列设计靶点gRNA1、gRNA2、gRNA3、gRNA4；2构建ClSPO11-2CRISPRCas9双靶位敲除载体；gRNA1和gRNA2，gRNA3和gRNA4分别组合双靶点；1利用限制性内切酶BsaI-HF对CRISPRCas9载体pBSE402进行酶切，回收酶切后的载体pBSE402；2以中间载体pCBC-DT1T2为模板，利用引物Target1-1FTarget1-2R和Target1-3FTarget1-4R分别进行PCR扩增，分别回收目的片段1和目的片段2；3将步骤1酶切后的载体pBSE402与步骤2回收的目的片段分别进行同源重组，转化DH5α感受态；4将步骤3得到的菌落分别摇菌并抽提重组质粒，测序比对，将测序正确的重组质粒分别转化至农杆菌EHA105感受态中；5将步骤4得到的菌落进行PCR检测，验证正确后进行西瓜遗传转化；3西瓜遗传转化经过侵染、共培养、恢复培养、选择培养、芽伸长培养和生根培养阶段得到转基因植株；4将步骤3获得的转基因植株进行基因编辑检测，将基因编辑植株移栽至试验田进行无籽表型观察。
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百度查询： 西北农林科技大学 一种通过基因编辑ClSPO11-2创制二倍体无籽西瓜的方法
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