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申请/专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所

摘要：本发明属于实验动物遗传育种技术领域，公开了一种单一毛色近交系合作小型猪培育方法及遗传辅助鉴定方法。以原产地合作猪为原始种子，以体表毛色松鼠背色和小体型为控制目标定向遗传；将具有松鼠背色的小体型合作猪以兄妹或父女、母子方式交配进行繁殖，选留松鼠背色和小体型子代猪作为种猪继续繁殖，近交繁育15代以上，追踪观察和测定其外貌特征、生长发育、生产性能以及繁殖性能指标；经封闭定向近交选育，使松鼠背色遗传性状完全稳定，并通过10个微卫星DNA遗传多态性位点检测辅助鉴定和控制，获得了松鼠背色合作小型猪的关键遗传位点标志。本发明填补了国际这一领域的空白，解决了单一毛色近交系合作小型猪遗传控制和鉴定的难题。

主权项：1.一种单一毛色近交系合作小型猪培育方法使用的遗传辅助鉴定方法，其特征在于，所述单一毛色近交系合作小型猪培育方法使用的遗传辅助鉴定方法包括：第一步，建立松鼠背色合作小型猪近交家系种群繁殖单元；第二步，通过10个微卫星DNA座位S0005、S0090、SW769、S0218、CGA、SW240、SW72、SW857、S0355、SW24的等位基因测定技术，监测松鼠背色合作小型猪特有的微卫星DNA位点的等位基因及其特征；所述DNA座位CGA，染色体位置1q，等位基因数12，等位基因范围250-320bp；引物序列：F-ATAGACATTATGTAAGTTGCTGAT，R-GAACTTTCACATCCCTAAGGTCGT；扩增关键条件：Tm55℃，Mg2+2.5mM；所述DNA座位SW240，染色体位置2P，等位基因数8，等位基因范围96-115bp；引物序列：F-AGAAATTAGTGCCTCAAATTGG，R-AAACCATTAAGTCCCTAGCAAA；扩增关键条件：Tm55℃，Mg2+1.5mM；所述DNA座位SW72，染色体位置3P，等位基因数8，等位基因范围96-115bp；引物序列：F-ATCAGAACAGTGCGCCGT，R-GTTTGAAAATGGGGTGTTTCC；扩增关键条件：Tm55℃，Mg2+1.5Mm；所述DNA座位SW0005，染色体位置5q，等位基因数10，等位基因范围205-248bp；引物序列：F-TCCTTCCCTCCTGGTAACTA，R-GCACTTCCTGATTCTGGGTA；扩增关键条件：Tm55℃，Mg2+3.0mM；所述DNA座位S0090，染色体位置12q，等位基因数4，等位基因范围244-251bp；引物序列：F-CCAAGACTGCCTTGTAGGTGAATA，R-GCTATCAAGTATTGTACCATTAGG；扩增关键条件：Tm55℃，Mg2+1.5mM；所述DNA座位SW769，染色体位置13，等位基因数7，等位基因范围106-140bp；引物序列：F-GGTATGACCAAAAGTCCTGGG，R-TCTGCTATGTGGGAAGAATGC；扩增关键条件：Tm55℃，Mg2+3.0mM；所述DNA座位SW857，染色体位置14，等位基因数6，等位基因范围144-160bp；引物序列：F-TGAGAGGTCAGTTACAGAAGACC，R-GATCCTCCTCCAAATCCCAT；扩增关键条件：Tm55℃，Mg2+1.5mM；所述DNA座位SW355，染色体位置15，等位基因数14，等位基因范围243-277bp；引物序列：F-TCTGGCTCCTACACTCCTTCTTGATG，R-GTTTGGGTGGGTGCTGAAAAATAGGA；扩增关键条件：Tm55℃，Mg2+3.0mM；所述DNA座位SW24，染色体位置17，等位基因数8，等位基因范围96-121bp；引物序列：F-CTTTGGGTGGAGTGTGTGC，R-ATCCAAATGCTGCAAGCG；扩增关键条件：Tm55℃，Mg2+1.5mM；所述DNA座位S0218，染色体位置X，等位基因数8，等位基因范围164-184bp；引物序列：F-GTGTAGGCTGGCGGTTGT，R-CCCTGAACCCTAAAGCAAAG；扩增关键条件：Tm55℃，Mg2+1.5mM；第三步，以此为遗传标记辅助鉴定松鼠背色近交系合作小型猪所具有的遗传学和生物学特征，并与原合作猪以及其他小型猪品种品系相区别；提取所述第一步小型猪近交家系种群繁殖单元的猪的基因组DNA，选择猪染色体上的10个微卫星位点，设计合成10对引物，其中5'FAM荧光标记的等位基因CGA，F-ATAGACATTATGTAAGTTGCTGAT，R-GAACTTTCACATCCCTAAGGTCGT；5'FAM荧光标记的等位基因S0005：F-TCCTTCCCTCCTGGTAACTA，R-GCACTTCCTGATTCTGGGTA；5'FAM荧光标记的等位基因SW24：F-CTTTGGGTGGAGTGTGTGC，R-ATCCAAATGCTGCAAGCG；5'TAMRA荧光标记的等位基因SW240，F-AGAAATTAGTGCCTCAAATTGG，R-AAACCATTAAGTCCCTAGCAAA；5'TAMRA荧光标记的等位基因SW72：F-ATCAGAACAGTGCGCCGT，R-GTTTGAAAATGGGGTGTTTCC；5'TAMRA荧光标记的等位基因S0090：F-CCAAGACTGCCTTGTAGGTGAATA，R-GCTATCAAGTATTGTACCATTAGG；5'TAMRA荧光标记的等位基因SW857：F-TGAGAGGTCAGTTACAGAAGACC，R-GATCCTCCTCCAAATCCCAT；5'TAMRA荧光标记的等位基因S0218：F-GTGTAGGCTGGCGGTTGT，R-CCCTGAACCCTAAAGCAAAG；5'HEX荧光标记的等位基因SW769：F-GGTATGACCAAAAGTCCTGGG，R-TCTGCTATGTGGGAAGAATGC；5'HEX荧光标记的等位基因S0355：F-TCTGGCTCCTACACTCCTTCTTGATG，R-GTTTGGGTGGGTGCTGAAAAATAGGA；采用PCR法扩增猪基因组DNA微卫星位点的等位基因，将10个基因座的PCR扩增产物采用2%的普通琼脂糖凝胶电泳检测，其中近交合作猪和原产地合作猪通过PCR扩增获得相应的目的片段；STR检测与基因型的判定，根据琼脂糖检测的结果，对PCR产物进行稀释；若2%的琼脂糖检测的条带亮度相同，PCR的扩增效率相同，则FAM、HEX、TAMRA三种标记的十个位点的PCR产物分别取1μL混合，加到每孔含8.5μL的甲酰胺和内标的96孔板上，860μL甲酰胺加10μL内标，混匀，分装到96孔板上，95ºC变性5min，放在冰上；待96孔板降温后，取出96孔反应板后使用遗传分析仪检测STR样本，测定每个样品的STR序列长度、组成和信号强度，原始峰图用基因分型软件进行分析，确定特定位点各个体的峰形和大小，判定个体的基因型；扫描结果出现两种波形：一种为纯合基因型，只有一个主波；另一种为杂合基因型，有两个主波；同时，根据软件读出波峰处的扩增产物的bp数，由基因分型软件读出每个样本在每个微卫星位点的扩增片段大小，每个位点的等位基因根据扩增片段从小到大顺序排列纪录为a、b、c、d；所述单一毛色近交系合作小型猪培育方法包括：（1），以原产地合作猪为原始种子，以体表毛色松鼠背色和小体型为控制目标定向遗传；（2），将具有松鼠背色的小体型合作猪以兄妹或父女、母子方式交配进行繁殖，选留松鼠背色和小体型子代猪作为种猪继续繁殖，近交繁育15代以上，追踪观察和测定其外貌特征、生长发育、生产性能以及繁殖性能指标；（3），经封闭定向近交选育，使松鼠背色遗传性状完全稳定，并通过10个微卫星DNA遗传多态性位点检测辅助鉴定和控制，获得了松鼠背色合作小型猪的关键遗传位点标志。

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百度查询： 中国农业科学院兰州兽医研究所 单一毛色近交系合作小型猪培育方法及遗传辅助鉴定方法