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申请/专利权人：四川华大生命科技有限公司

摘要：本发明属于干细胞的制备技术领域，具体涉及一种经血间充质干细胞的提取培养方法，制备方法包括收集样品、MenSCs的提取分离、MenSCs的原代的收集、MenSCs的传代培养，制备的经血间充质干细胞可稳定的传代培养到15代以后；本发明制备经血间充质干细胞原料通过体外收集的方式，利用木菠萝提取物制备的培养基并通过筛选较好状态的原代细胞，克服了经血间充质干细胞无法稳定的传代到15代以后的问题，同时本申请的培养基为无血清成分，极大地降低了外源物引发的风险，本发明提供了一种符合药品生产质量管理规范化的MenSCs分离、收集和传代等操作流程，适用于工业化大规模生产。

主权项：1.一种经血间充质干细胞的提取培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.收集样品：采用体外组织收集的方式，在发现有肉类样或者凝血样的内容物时，并置于装有抗凝剂、抗生素、混合酶以及培养基的第一保存管中，所述抗凝剂、抗生素和培养基溶液的体积比为1:1:80~120，所述培养基含重组人血清白蛋白、转铁蛋白、重组人表皮生长因子、胰岛素、总含量低于1.5mgml的基础培养基，0.006mMmlL-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液，HEPES缓冲液PH7.2-7.5，1.5gL的NaHCO3；5-20ngml重组人血管内皮生长因子OsrhVEGF和2-3ngml重组人碱性成纤维细胞生长因子bFGF，50-120ngml重组人类胰岛素生长因子-1rhIGF-1LR3，15-10ngml木菠萝提取物，所述抗凝剂为肝素钠，抗生素为5kUml青霉素-5mgml链霉素10mgml-新霉素溶液PSN，100×，所述混合酶包括1%的II型胶原蛋白酶、1%的胰蛋白酶；S2.MenSCs的提取分离：将样品离心分离洗涤后，每瓶样品加入5ml促贴剂，完全浸润瓶底，所述促贴剂包括0.1mgmL多聚-L-赖氨酸溶液10×，37℃，5%CO2孵育60min后弃去包被液，用PBS清洗一次，剪碎均匀的铺在添加了培养基的T25培养瓶中；S3.MenSCs的原代的收集：37℃，5%CO2浓度下贴壁培养，观察细胞的生长状况及有无污染，培养基添加了400ngml的氢化可的松，第4天半量更换培养基一次，去除未贴壁生长的细胞，待贴壁细胞生长后每48-72h更换培养基，待融合度达到80-90%时即可消化收获MenSCs的原代；S4.MenSCs的传代培养：将收获后的MenSCs的原代放置于培养瓶中，置于37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养至80-90%融合度时操作进行传代接种；P4代及以后培养：干细胞温和酶消化成单细胞后，使用LIPUS辐照子宫内膜干细胞，强度为20P，采用25mWcm2输出功率，频率为10kHz，LIPUS辐照输出1S的强度为P。

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