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申请/专利权人：南京医拓生物科技有限公司

摘要：本申请公开了一种腹水来源CD8+TIL的分离培养方法及应用，属于免疫细胞及免疫细胞治疗技术领域。该分离培养方法包括腹水采集及单个核细胞分离、纯化分离淋巴细胞、初始培养、扩增培养和CD8+TIL收集，采用分阶段培养的方式，初始培养采用较低的IL‑2浓度，抑制CD4+细胞的扩增；扩增培养采用较高的IL‑2浓度，促进TIL细胞存活、增殖和分化，同时加入TWS119抑制CD8+TIL过度分化，以在后续持续扩增过程中维持CD8+TIL的细胞记忆性及干性，增强CD8+TIL增殖及抗肿瘤能力。使用了CD8+TIL细胞培养体系代替了磁珠分选的步骤，可以定向培养CD8+TIL，减少了TIL在分选过程中的损失；并且可避免磁珠分选引起的细胞过度活化、细胞耗竭和磁珠残留的风险，极大的降低了CD8+TIL的培养成本，缩短了CD8+TIL制备周期。

主权项：1.一种腹水来源CD8+TIL的分离培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1，腹水采集及单个核细胞分离，包括：无菌条件下采集恶性腹水；将采集的恶性腹水过滤后离心弃上清，用生理盐水重悬沉淀获得腹水来源细胞悬液；采用Ficoll密度梯度离心法提取单个核细胞，生理盐水重悬后离心弃上清，获得腹水单个核细胞沉淀物；S2，纯化分离淋巴细胞，包括：去除S1中的腹水单个核细胞中的贴壁细胞，获得纯化的淋巴细胞；S3，初始培养，包括：用TIL初始培养体系重悬S2中的淋巴细胞获得淋巴细胞悬液，接种后置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；TIL初始培养体系包括：GT-T551H3完全培养基，细胞因子IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、胸腺肽α1、αCD3、αCD28；S4，扩增培养，包括：初始培养3～5天后，当显微镜下细胞密度达到70％～80％时，加入TIL扩增培养体系，混匀后置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养；TIL扩增培养体系包括：GT-T551H3完全培养基，细胞因子IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、胸腺肽α1、αCD3、αCD28、TWS119、维生素C；S5，CD8+TIL收集，包括：当细胞计数达到目标量时，离心弃上清，获得CD8+TIL。

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