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申请/专利权人：甘肃农业大学

摘要：本发明提供一种基于抗生素胁迫下的苇状羊茅生长方法，涉及农业领域，包括如下步骤：供试菌株的选取及保存，培养基的选取，供试菌株的活化，接种菌悬液制备，供试种子处理，抗生素浓度的筛选，羊茅幼苗实验，羊茅生长指标测定，羊茅光合参数测定，本发明通过将分离自苇状羊茅‑岩羊2号种子中得到的一株来自假单胞菌属的细菌YY12接种到羊茅植株上，对处于磺胺嘧啶胁迫下羊茅植株的抗氧化系统、防御酶和可溶性物质等生理指标具有显著的影响，对其生长具有促进作用，此外，对于正常生长的羊茅植株也具有明显的促进作用。

主权项：1.一种基于抗生素胁迫下的苇状羊茅生长方法，其特征在于：包括如下步骤：1供试菌株的选取及保存分离自苇状羊茅-岩羊2号种子的一株来自假单胞菌属的细菌YY12，将菌株YY12保存于-80℃冰箱中；2培养基的选取选取TSA培养基和NB培养液用于供试菌株的活化和扩繁；3供试菌株的活化取出保存于-80℃的菌株YY12，首先在-20℃下复苏30min，然后在4℃下复苏1h，最后在室温条件下复苏30min；将复苏后的菌株划线接种于TSA平板上，在30℃的恒温培养箱中孵育48h，然后挑取单菌落再接种到TSA平板上，在30℃下培养24h用于后续的实验；4接种菌悬液制备将供试菌株接种于NB培养液中在温度为30℃、转速为160rmin的恒温摇床中培养24h，然后在8000rmin的条件下离心15min并弃掉上清液，将获得的菌体在生物安全柜中重悬于无菌水中，以此制备成供后续实验用的接种菌悬液108CFUmL；5供试种子处理挑选健康饱满、大小一致的供试种子并对其进行表面消毒，首先将种子置于75％的乙醇中消毒2min，然后置于3％的次氯酸钠中消毒8min，最后用无菌水冲洗3次备用；6抗生素浓度的筛选羊茅种子消毒后，在超净工作台中用镊子将将种子放入底部铺有2层滤纸的干净玻璃培养皿，每皿50粒，加入不同浓度磺胺嘧啶溶液1、2、5、10、20、40、80mgL，每皿4mL，对照组CK加入等量蒸馏水，实验设置8个处理，每个处理4个重复；将培养皿放入恒温的培养箱中进行培养；种子萌发期间每日补充少量磺胺嘧啶溶液以保持滤纸湿润，观察种子萌发情况，于实验处理第7天计算发芽势，第10天测量胚根长度，统计发芽率胚根长度达到种子全长的12视为发芽；7羊茅幼苗实验选取籽粒健康饱满、大小基本一致消毒后的羊茅种子数粒，置于铺两层滤纸的培养皿中，28℃恒温条件下培养5d，挑选已发芽且长势一致的羊茅转移至装有等量已高温灭菌细沙121℃、高温灭菌21min的育苗杯直径9cm、高13cm中，然后将育苗杯摆放在水培盒中，置于光照培养室每天光照16h，昼夜温度分别为23℃，20℃，相对湿度为55％中培养，期间用Hoagland营养液浇灌每3d更换一次营养液进行强化；每杯保留长势一致的幼苗30株，1周后进行磺胺嘧啶胁迫处理；使用磺胺嘧啶溶液浇灌根际，对照组浇灌等量蒸馏水，然后将育苗杯摆放在装有等量蒸馏水或抗生素的水培盒中，置于光照培养室中培养；待其胁迫2周后，使用制备好的菌悬液浇灌幼苗根际，对照浇灌等量的蒸馏水，处理2周后，分别取样测定各项指标；选取合适浓度的磺胺嘧啶溶液作为胁迫浓度，实验共设置4个处理：蒸馏水对照CK，蒸馏水+菌悬液T0，磺胺嘧啶处理T1，磺胺嘧啶处理+菌悬液T2，每个处理6个重复；8羊茅生长指标测定株高和根长：每处理随机选取15株幼苗，用直尺进行测量其长度；鲜重：每处理随机选取15株幼苗，分离地上和地下部分，用蒸馏水冲洗干净，擦干水分后分别将地上鲜重和地下鲜重称重；9羊茅光合参数测定将各处理组的叶片样品取0.1g浸泡在含有5mL95％乙醇的试管中，然后将每个试管用锡纸完全包裹以隔绝光源，将其置于室温下静置48h，至叶片呈白色，之后，吸取上清液并测量其在470nm、665nm以及649nm处的吸光值A用于计算叶绿素aChla和叶绿素bChlb的含量；计算公式为：Chla＝13.95×A665-6.88×A649×5×10-3FW；Chlb＝24.96×A649-7.32×A665×5×10-3FW；总叶绿素含量ChlT＝Chla+Chlb；采用便携式光合测量系统GFS-3000测量各实验组植物叶片的光合参数，包括净光合速率Pn、气孔导度Gs、细胞间CO2Ci和蒸腾速率Tr，测定时间为上午9:00-11:00之间，测定时将CO2浓度和光强分别设置为380μmolm2s和1000μmolm2s，测量完成后，计算光合参数Pn、Ci、Gs和Tr。

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