买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：四川农业大学

摘要：本发明提供了一种成年牦牛鼻咽上皮细胞的分离培养方法，首先采集牦牛鼻咽粘膜组织，用含复合抗生素的生理盐水和含复合抗生素的PBS缓冲液进行前处理，然后按照先IV型胶原蛋白酶后胰蛋白酶对组织进行消化；利用含有复合抗生素的完全培养基重悬细胞后，将其接种于细胞培养瓶中进行培养；利用刮除法结合差速贴壁法并且配合胰蛋白酶消化液去除成纤维细胞，从而获得成年牦牛鼻咽上皮细胞；本发明提供的方法能够快速地分离出成年牦牛鼻咽上皮细胞，获得贴壁生长迅速、活力高且稳定传代的细胞；这一发明为牦牛鼻咽粘膜的生理调控和病原体感染机制研究提供了实验细胞模型，具有重要的科研价值和应用前景。

主权项：1.一种成年牦牛鼻咽上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述分离培养方法包括以下步骤：步骤S1：将获取的新鲜牦牛头颅立即使用液压机床将其从中间破开，露出鼻咽部；使用无菌剪刀和镊子从上颚骨上剪下鼻咽上皮组织，立即使用含3wt%-5wt%复合抗生素的生理盐水冲洗鼻咽上皮组织表面的黏液和血污，之后在含1wt%-3wt%复合抗生素的1×PBS中漂洗三遍；最后将漂洗过的鼻咽上皮组织放入含1wt%-2wt%复合抗生素的1×PBS的离心管中，并立即使用封口胶密封离心管口后运回实验室进行后续处理，保证鼻咽上皮组织在离心管中的浸泡时间；步骤S2：在超净工作台上操作，先从步骤S1中的离心管中取出鼻咽上皮组织，细心剪除边缘部分；将剩余的中心部分的组织剪切成碎块；将这些碎块与1mgml-1.5mgml的IV型胶原蛋白酶混合，在37℃下孵育；步骤S3：步骤S2中孵育完成后，加入含10wt%-15wt%FBS的DMEMF12基础培养基混合，停止消化反应，并收集细胞悬液；将收集到的细胞悬液过200目-300目的滤网，再次收集过滤后的细胞悬液；离心，弃上清液，得到细胞沉淀；步骤S4：向步骤S3中得到的细胞沉淀中加入5ml-10ml浓度为0.25wt%-0.3wt%胰蛋白酶消化液，消化组织；消化结束后，立即加入10ml-20ml完全培养基以终止消化，并离心，弃去上清液，得到细胞沉淀；步骤S5：用完全培养基重新悬浮步骤S4中得到的细胞沉淀，并将其以每瓶2-3×105个细胞的密度分配至一个或多个T25细胞培养瓶中；把这些培养瓶置于细胞培养箱中进行培养；每日观察细胞的生长状况，直至细胞覆盖度达到50-60%；此时，在显微镜的视野中可以看到聚集成团的上皮样细胞群落；在培养瓶底部清晰标记出这些上皮细胞区域；倒掉培养液，并用预热至37℃的1×PBS小心清洗；用细胞刮刀谨慎地去除标记区域以外的成纤维细胞，并再次用预热至37℃的1×PBS清洗3-5遍剩下的细胞；加入新鲜的完全培养基，继续培养，并每天使用细胞刮刀清除新生长的成纤维细胞，直到上皮细胞覆盖超过整个细胞瓶面积的80%；步骤S6：最后一次成纤维细胞的刮除之后，用胰蛋白酶消化液对上皮细胞进行消化处理，随即加入2ml-3ml完全培养基以终止消化过程，轻轻吹打细胞瓶底部以促进细胞分离；将细胞悬液吸出后以800-1000转分钟速度离心5-8分钟，弃去上清液；再将得到的细胞沉淀重新悬浮于5ml-10ml的完全培养基中，并将其转移到培养箱重新培养；45-60分钟后，将培养液及未贴壁细胞一同吸出，混匀后转移到新的培养瓶中；此过程需要重复3-5次，以彻底清除残留的成纤维细胞；步骤S7：当细胞生长至80-90汇合度后，将培养瓶中的培养液倒掉，并用常温的1×PBS冲洗3-5遍；向细胞瓶中加入胰蛋白酶消化液进行消化处理；立即加入2ml-3ml完全培养基混匀以终止消化，轻轻吹打细胞瓶底部；将细胞悬液吸出后以800-1000转分钟速度离心5-8分钟，弃去上清液；将细胞沉淀用5ml-10ml完全培养基重悬后放入培养箱重新培养；步骤S8：当细胞生长至培养瓶的80-90%时，按1：2-3的比例进行传代，或使用无血清冻存液将细胞冻存至液氮中以备保存；所述复合抗生素由青霉素、链霉素和两性霉素B组成，其组分质量配比为：5-8mgml青霉素G、8-12mgml链霉素和20-30μgml两性霉素B；所述完全培养基包括：1wt%-1.5wt%的复合抗生素、1wt%-1.5wt%胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂ITS-G、20-40ngml表皮生长因子hEGF、10wt%-15wt%胎牛血清FBS以及余量的DMEMF12。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 四川农业大学 一种成年牦牛鼻咽上皮细胞的分离培养方法