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申请/专利权人：苏州和合医学检验有限公司

摘要：本发明涉及血药浓度测定方法技术领域，且公开了血清中叶酸和5‑甲基四氢叶酸的血药浓度测定方法，包括以下步骤，样本的采用，采用2％小牛血清白蛋白生理盐水溶液与叶酸和5‑甲基四氢叶酸标品进行混合，高度模拟临床真实样本。该血清中叶酸和5‑甲基四氢叶酸的血药浓度测定方法，通过建立一种快速、准确、灵敏度高的液质联用方法，用于测定患者血清中叶酸和5‑甲基四氢叶酸的血药浓度，采用2％小牛血清白蛋白生理盐水溶液与叶酸和5‑甲基四氢叶酸标品进行混合，高度模拟临床真实样本，LC‑MSMS法具有色谱的高分离度，同时还具有质谱的高选择性、高灵敏度，二者有效结合进行叶酸和5‑甲基四氢叶酸的快速、准确定量。

主权项：1.血清中叶酸和5-甲基四氢叶酸的血药浓度测定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、样本的采用采用2％小牛血清白蛋白生理盐水溶液与叶酸和5-甲基四氢叶酸标品进行混合，高度模拟临床真实样本；S2、性能参数检测限LOD：叶酸：1ngmL；5-甲基四氢叶酸：1ngmL；测定低限LOQ：叶酸：2ngmL；5-甲基四氢叶酸：2ngmL；线性范围：叶酸：2ngmL-100ngmL；5-甲基四氢叶酸：2ngmL-100ngmL；方法验证时，回收率和精密度的要求：回收率为85％-115％，精密度为RSD15％；稳定性：储备液长期稳定性、模拟样品处置前室温放置4h稳定性、模拟样品处置后4℃放置24h稳定性、模拟样品反复冻融3次稳定性、模拟样品-80℃长期存放稳定性；S3、原始样本系统样本类型为血清，其样本采集通过采血针采集静脉全血，全血离心，取上清即得血清，样本保存在-80℃保存容器中；S4、空白血清的来源因叶酸和5-甲基四氢叶酸是内源性物质，本实验采取用替代基质来做标准曲线和质控样品，替代基质为2％小牛血清白蛋白的生理盐水溶液，生理盐水为自己配制的；S5、所需试剂S5.1、水：超纯水，由实验室Poll超纯水仪所制；乙腈、甲醇、乙醇、甲酸、25molL氢氧化钠：质谱级，Fisher公司；溶液如下：流动相：0.05％甲酸水溶液A—乙腈B；S5.2、标准品与各种溶液所用溶液的配制：精密称取叶酸标品2.822mg，乘以纯度系数92.3％，用5％NaOH20％乙醇水溶液配制成浓度为0.5mgmL的叶酸储备液，于-20℃冰箱中保存备用，精密称取5-甲基四氢叶酸钙标品2.260mg，除以校正因子后，用5％NaOH、20％乙醇水溶液配制成浓度为0.5mgmL的5-甲基四氢叶酸储备液，于-20℃冰箱中保存备用；内标母液与工作液的配制：精密称取甲氨喋呤标品2.147mg，用5％NaOH、20％乙醇水溶液配制成浓度为0.5mgmL的甲氨喋呤储备液，于-20℃冰箱中保存备用；精密移取上述配制好的甲氨喋呤母液0.02mL，置于1.5mL离心管中，加入0.98mL甲醇：水稀释，其配比为1:1，混匀，得浓度为10000ngmL的甲氨喋呤内标溶液1；再次精密移取0.01mL甲氨喋呤内标溶液1，置于1.5mL离心管中，加入0.99mL甲醇：水稀释，其配比为1:1，混匀，得浓度为100ngmL的甲氨喋呤内标溶液2；内标工作液即沉淀剂，为甲氨喋呤浓度为2ngmL的甲醇溶液，含0.1mgmLVC；取10μL维生素C储备液，20μL甲氨喋呤内标溶液2加入到970μL的甲醇中，即沉淀剂；维生素C溶液的配制：精密称取一定量的维生素C，用超纯水配制成浓度为10mgmL维生素C储备液，于-20℃冰箱中保存备用，取10μL维生素C储备液，加入到990μL的水中，涡旋得到0.1mgmL的维生素C工作液；9％氯化钠水溶液的配制：精密称取一定量的氯化钠，用超纯水配制成浓度为0.9％氯化钠水溶液，于4℃冰箱中保存备用；标准曲线工作稀释液和复溶液10％乙腈水，含0.1mgmLVC：取10μL维生素C储备液，100μL纯乙腈，加入到890μL的水中，涡旋得到标准曲线工作稀释液和复溶液；S5.3、质控样品工作溶液的配制分别精密移取配制好的叶酸和5-甲基四氢叶酸母液0.02mL至1.5mL离心管中，加入0.96mL的10％乙腈水溶液进行稀释，含VC浓度为0.1mgmL，得浓度为10000ngmL的混合质控工作液1；HQC工作液：精密移取配制好的，质控工作液1，0.160mL至1.5mL离心管中，加入0.840mL的10％乙腈水进行稀释，含VC浓度为0.1mgmL，得浓度为1600ngmL的混合质控工作液2，此溶液为高浓度质控工作液；MQC工作液：精密移取配制好的质控工作液2，0.5mL至1.5mL离心管中，加入0.5mL的10％乙腈水进行稀释，含VC浓度为0.1mgmL，得浓度为800ngmL的混合质控工作液3，此溶液为中浓度质控工作液；精密移取配制好的质控工作液3，0.5mL至1.5mL离心管中，加入0.5mL的10％乙腈水进行稀释，含VC浓度为0.1mgmL，得浓度为400ngmL的混合质控工作液4；LQC工作液：精密移取配制好的质控工作液4，0.3mL至1.5mL离心管中，加入0.7mL的10％乙腈水进行稀释，含VC浓度为0.1mgmL，得浓度为120ngmL的混合质控工作液5，此溶液为低浓度质控工作液；上述配制好的质控工作液均于-20℃冰箱中保存备用；S6、标准曲线工作液的配制精密移取上述配制好的叶酸和5-甲基四氢叶酸0.02mL，置于1.5mL离心管中，加入0.960mL标准曲线稀释液稀释，涡旋混匀，得浓度为10000ngmL的混合工作液1；标准曲线L1点：精密移取0.2mL配制好的工作液1，置于1.5mL离心管中，加入0.8mL10％乙腈水稀释，含VC浓度为0.1mgmL，涡旋混匀，得浓度为2000ngmL的混合工作液2；标准曲线L2点：精密移取0.5mL配制好的工作液2，置于1.5mL离心管中，加入0.5mL10％乙腈水稀释，含VC浓度为0.1mgmL，涡旋混匀，得浓度为1000ngmL的混合工作液3；标准曲线L3点：精密移取0.4mL配制好的工作液3，置于1.5mL离心管中，加入0.6mL10％乙腈水稀释，含VC浓度为0.1mgmL，涡旋混匀，得浓度为400ngmL的混合工作液4；标准曲线L4点：精密移取0.5mL配制好的工作液4，置于1.5mL离心管中，加入0.5mL10％乙腈水稀释，含VC浓度为0.1mgmL，涡旋混匀，得浓度为200ngmL的混合工作液5；标准曲线L5点：精密移取0.2mL配制好的工作液5，置于1.5mL离心管中，加入0.3mL10％乙腈水稀释，含VC浓度为0.1mgmL，涡旋混匀，得浓度为160ngmL的混合工作液6；标准曲线L6点：精密移取0.2mL配制好的工作液6，置于1.5mL离心管中，加入0.2mL10％乙腈水稀释，含VC浓度为0.1mgmL，涡旋混匀，得浓度为80ngmL的混合工作液7；标准曲线L7点：精密移取0.2mL配制好的工作液7，置于1.5mL离心管中，加入0.2mL10％乙腈水稀释，含VC浓度为0.1mgmL，涡旋混匀，得浓度为40ngmL的混合工作液8；标曲各点工作液置于冰箱中-20℃保存备用；S7、程序步骤S7.1、标准曲线样品的制备分别取空白2％小牛血清白蛋白生理盐水溶液50μL，加入5μL0.1mgmL的VC水溶液，分别加入2.5μL标准曲线系列浓度混合工作液，制得浓度范围为2-100ngmL的标准曲线样品，然后，按照血清样本的处理方法进行处理，分析测定，每次测定时，新鲜配制；S7.2、质控样品的制备分别取2％小牛血清白蛋白生理盐水溶液50μL，加入5μL、0.1mgmL的VC水溶液，分别加入配制的3个浓度叶酸和5-甲基四氢叶酸混合质控工作液2.5μL，涡旋混匀5min，制得浓度分别为80ngmL的HQC质控样品、40ngmL的MQC质控样品、6ngmL的LQC质控样品；然后，按照血清样本的处理方法进行处理，分析测定，质控样品配制一次，按照血清样本的处理方法可连续进行7批样本的处理测定，相关的稳定性实验已进行了考察，待上批次配制的质控样品使用完后，再配制下一批质控样品；S7.3、血清样本的处理方法取血清样品50μL至1.5mL离心管中，加入5μL0.1mgmL的VC水溶液，2.5μL的10％乙腈水溶液，含VC浓度为0.1mgmL，200μL浓度位2ngmL的甲氨喋呤甲醇溶液，含VC浓度为0.1mgmL，3500rpm，涡旋混匀5min，4℃、15000rmin离心10min，取上清液150μL至1.5mL离心管中室温氮气吹干，加入80μL10％乙腈水溶液，含VC浓度为0.1mgmL，3500rpm，涡旋5min，4℃、15000rmin离心5min，取70μL上清用于进样分析；S7.4、替代基质空白样品的处理方法取2％小牛血清白蛋白生理盐水溶液50μL，加入200μL空白甲醇，3500rpm，涡旋混匀5min，4℃、15000rmin离心10min，取上清液150μL至1.5mL离心管中室温氮气吹干，加入80μL10％乙腈水溶液，含VC浓度为0.1mgmL，3500rpm，涡旋5min，4℃、15000rmin离心5min，取70μL上清用于进样分析；S7.5、样品进样表Worklist的编写DoubleBlank2％小牛血清样本+标准曲线+高、中、低质控样品+真实临床样品+DoubleBlank2％小牛血清样本+真实临床样品+高、中、低质控样品，依次排列样品；S7.6、LCMS分析条件S7.6.1、LC分析条件色谱柱：Waters，ACQULTYUPLC，BEHC18；柱温：25℃；流动相：0.05％甲酸水溶液A—乙腈B；流速：0.22mLmin；进样量：5μL；洗脱方式：梯度洗脱；S7.6.2、MS分析条件S7.6.3、按照的操作岛津LC-MSMS8050SOP分别把MS和LC打开；按照实验要求设置液相及质谱条件，平衡系统10min，开始批量进样分析，软件计算数值即为报告结果，并进行结果分析；S8、质量控制程序S8.1、选择性专属性比较空白样品与LLOQ标曲最低浓度点的色谱图，空白样品中待测物响应值不应超LLOQ中待测物的20％；空白样品中内标物对LLOQ中待测物的干扰不应超过LLOQ的20％；空白样品中内标物对LLOQ中内标物的干扰，不应超过内标响应的5％；S8.2、残留考察分别移取2％小牛血清白蛋白生理盐水溶液50μL，置于1.5mL离心管中，分别加入配制的标准曲线工作液12.5μL、标准曲线工作液72.5μL，按照血清样本的处理方法进行样品的处理，进样分析测定，样品的进样顺序为：3针L7点+20针L1点+3针空白血清样品；待上述样品序列完成以后，空白样品中残留的待测物响应值不应超过LLOQ中待测物质的20％，空白样品中残留的内标物响应值不应超过LLOQ中内标物质的5％；S8.3、标曲与质控每一分析批标准曲线至少有7个校正浓度点，各浓度点的准确度应在85～115％；标准曲线的所有测试点中，应有75％的点符合上述标准，以符合标准的点进行回归计算，回归方程的相关系数R及R2值应大于0.99，质控各浓度点的准确度应在85～115％；S8.4、精密度与准确度日内及日间精密度RSD小于15％，日内及日间准确度RE在理论值的±15％范围内，至少有23的QC样品符合上述标准，同一浓度至少有50％符合标准。

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