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申请/专利权人：安徽医科大学

摘要：一种预防弓形虫病的减毒活疫苗及其构建方法与应用。通过CRISPRCas9介导的基因编辑技术在中国优势型Chinese1型WH3虫株上突变弓形虫效应分子ROP18来构建WH3Δrop18虫株。使用WH3Δrop18免疫BALBc小鼠，通过小鼠模型评估WH3Δrop18减毒活株作为疫苗的保护性免疫。研究发现，WH3Δrop18减毒活疫苗安全性良好，可以保护小鼠抵御多种弓形虫虫株引起的急性与慢性感染，表明该减毒虫株具有成为弓形虫基因工程疫苗的潜力。

主权项：1.一种弓形虫减毒株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：构建靶向ROP18的Cas9质粒使用Q5®定点突变试剂盒，并按照Q5®定点突变试剂盒说明书的操作方法将CRISPRCas9质粒pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT中的sgRNA替换为靶向ROP18的sgRNA；使用的引物如下：5’-ROP18-gRNA：GTCGTCCGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG3’-ROP18-gRNA：GGTACGCGTAAACTTGACATCCCCATTTAC步骤2：构建同源供体DNA按照诺唯赞高保真聚合酶P525说明书对各个同源臂片段进行扩增；以WH3虫株的基因组DNA为模板，扩增ROP185’-和ROP183’-同源臂片段，从pUPRT-DHFR中扩增DHFR-TS序列：使用多片段一步快速克隆试剂盒将ROP185’-同源臂片段、ROP183’-同源臂片段以及DHFR-TS序列这三个片段通过同源重组克隆到pUC19线性化载体之间，构建三片段的供体DNA质粒；其中ROP185’-同源臂片段UpROP18F的引物为：AAAACGACGGCCAGTGAATTCACAGGAAACGCCAACAGACG；UpROP18R的引物为：GGGGGTGAAAATCGAATGACAAGAGGTGGCCGCTGTACCG；DHFR的引物为：DHFR*-TSF：TGTCATTCGATTTTCACCCCC；DHFR*-TSR：GGAGAAGAGTCGCTAAACCCAGGATCGATCCCCCCGGGCTGC；ROP183’-同源臂片段DnROP18F的引物为：GCAGCCCGGGGGGATCGATCCTGGGTTTAGCGACTCTTCTCC；DnROP18R的引物为：GACCATGATTACGCCAAGCTTAAGCATAGTCTCATCGGTGG；反应体系为：40ng线性化pUC19质粒，20ngUpROP18片段，60ngDHFR-TS片段，20ngDnROP18片段，4.0μL5×CEMultiSBuffer，2.0μLExnase®MultiS，ddH2O补液至20μL；步骤3：构建WH3Δrop18虫株将步骤1中构建的质粒pSAG1::Cas9-U6::sgROP18与步骤2中的同源供体DNA片段电穿孔转染到纯化的WH3速殖子中，并用乙胺嘧啶药物筛选，制备得到WH3Δrop18的混合克隆；步骤4：筛选并获得WH3Δrop18单克隆虫株通过倍比稀释法将单个弓形虫速殖子铺于有Vero细胞的96孔板中，8-12天后挑出有弓形虫逸出的孔铺于有Vero细胞的48孔板中扩大培养，5-7天后通过PCR和Westernblot检测阳性单克隆，获得单个克隆虫株；诊断性PCR包括PCR1、PCR2和PCR3，按照诺唯赞高保真聚合酶P525说明书对各个片段进行扩增；所述PCR1的引物为：5’-UpROP18：GATCTTCAGCAGCCTGGTTC；5’-InDHFR：TACCAGTCATGGACGAGATCG；所述PCR2的引物为：3’-InDHFR：ACACGCATGTCTACACGAACC；3’-DnROP18：CAAACCAATCACGACCTCTG；所述PCR3的引物为：5’-InROP18：AAGTTCTATCGCGCCACTCG；3’-InROP18：TTTGCCGATGACGCATCCAG。

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百度查询： 安徽医科大学 一种预防弓形虫病的减毒株及其构建方法与应用