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申请/专利权人：中国农业科学院烟草研究所

摘要：本发明公开了一种烟草黑胫病抗性鉴定装置及鉴定方法，涉及农作物抗病性鉴定技术领域。本发明方法包括以下步骤：黑胫病菌活化、诱导孢子悬浮液制备、待鉴定烟草种质幼苗样品侵染、统计并鉴定结果。本发明采用水培烟苗进行抗性鉴定，鉴定的过程也在水培环境中进行，保持了植株根部的完整性，防止根部损伤的不均衡造成的实验误差，且有助于观察发病情况与发病过程，用于精准控制接种强度，增强鉴定烟草种质黑胫病抗性的准确度。

主权项：1.一种使用烟草黑胫病抗性鉴定装置的烟草黑胫病抗性鉴定方法，其特征在于，所述烟草黑胫病抗性鉴定装置包括：透明筒、漂浮板、遮光罩与支架，所述透明筒用于盛放孢子悬浮液或清水，所述漂浮板表面开设有若干孔洞，所述漂浮板周侧面设有与孔洞相通的开口槽，所述孔洞和开口槽用于夹持待鉴定烟草种质幼苗样品，所述支架为圆筒状；所述烟草黑胫病抗性鉴定方法包括以下步骤：-黑胫病菌活化：配制燕麦培养基，并在每个一次性培养皿中倒入25mL培养基；在所述培养皿的培养基中接种黑胫病菌；将接好菌的培养皿进行封口，标记类型、日期；放置于28℃培养箱中；培养7d进行活化；用培养至第7d的烟草黑胫病菌进行扩繁，28℃培养至14d，进行孢子悬浮液制备；-孢子悬浮液制备：在黑胫病菌培养皿中加入15mL灭菌后0.1%的硝酸钾溶液；4℃黑暗培养20min；25℃光照培养25min；再将培养皿中液体移入50mL离心管中；通过血球计数板统一孢子悬浮液浓度至1×104个mL；-待鉴定烟草种质幼苗样品侵染：将待鉴定烟草种质幼苗样品置于漂浮板孔洞中，将孢子悬浮液倒入鉴定装置透明筒中，再放入带有待鉴定烟草种质幼苗样品的漂浮板；精确进行各部位的接种，使用支架将漂浮板高度进行固定，并调节孢子悬浮液深度使其浸泡至烟苗根尖、根毛、主根或根茎连接处；并盖上遮光罩，25℃黑暗环境下侵染3h；-统计并鉴定结果：拿掉遮光罩，并将装置中的孢子悬浮液换成清水，25℃光照环境下培养5d后，统计烟苗发病情况，并根据统计结果鉴定烟草黑胫病抗性情况；烟草播种，待烟草种质幼苗生长至小十字期，移栽至水培苗盘中，生长至大十字期的烟草种质幼苗可作为侵染样品；所述燕麦培养基的配制方法为：称取燕麦33g倒入锅中，加入去离子水500ml，煮沸；煮至燕麦呈黏糊状后，用纱布过滤；取滤液，定容至1000ml；加入18g琼脂；灭菌即制得燕麦培养基。

全文数据：一种烟草黑胫病抗性鉴定装置及鉴定方法技术领域本发明属于农作物抗病性鉴定技术领域，特别是涉及一种烟草黑胫病抗性鉴定装置及鉴定方法。背景技术烟草黑胫病（Phytophthoraparasiticavar.nicotiane）是烟草生产上最具毁灭性的病害之一，是制约我国各烟区烟叶生产的最重要因素，可以危害烤烟、晾烟、晒烟、白肋烟、香料烟等所有的栽培烟草。1896年，BreddeHaan在爪哇首次发现烟草黑胫病。1924年，Cook在波多黎再次观察到这个病害。此后，世界各主要产烟区陆续报道了烟草黑胫病发生为害情况，现该病已遍布温带、亚热带和热带各烟区。20世纪40年代，病区扩大到黄河流域、长江流域及珠江流域的各产烟省，在这些地区烟草黑胫病均已造成严重损失。据不完全统计，我国烟草黑胫病平均每年发病面积高达76373hm2，产量损失2869.26万kg，产值损失超过1.23亿元，仅次于烟草病毒病。生产实践表明，防治黑胫病最经济、有效、环保的措施就是选育抗病品种，抗性鉴定自然成为抗源挖掘利用、抗病育种、抗性监测等工作中重要的一环。因此，准确有效的抗性鉴定方法对烟草抗性材料的鉴定和抗病品种的选育是至关重要的。目前对烟草抗黑胫病种质材料的鉴定主要采用菌谷接种法。将谷子煮熟后在其中培养黑胫病菌作为接种源，将烟苗茎基部用小刀轻轻划伤口，接种0.5-1g菌谷，接种后2-3周调查发病情况。目前该技术存在问题如下：1、通过菌谷接种不能精确控制接种强度，因此不能准确鉴定出烟草种质抗黑胫病的差异；2、由于环境控制精确度不高，发病时间过长；3、不能准确控制接种部位，菌丝及孢子可能通过根部及茎基部侵染。发明内容本发明的目的在于提供一种烟草黑胫病抗性鉴定装置及鉴定方法，用于精准控制接种强度，增强鉴定烟草种质黑胫病抗性的准确度。本发明是通过以下技术方案实现的：本发明为一种烟草黑胫病抗性鉴定装置及鉴定方法，所述鉴定方法包括以下步骤：-黑胫病菌活化：配制燕麦培养基，并在每个一次性培养皿中倒入25mL培养基；在所述培养皿的培养基中接种黑胫病菌；将接好菌的培养皿进行封口，标记号类型、日期；放置于28℃培养箱中；培养7d进行活化；用培养至第7d的烟草黑胫病菌进行扩繁，28℃培养至14d，进行孢子悬浮液制备；-孢子悬浮液制备：在黑胫病菌培养皿中加入15mL灭菌后0.1%的硝酸钾溶液；4℃黑暗培养20min；25℃光照培养25min；再将培养皿中液体移入50mL离心管中；通过血球计数板统一孢子悬浮液浓度至1×104个mL；-待鉴定烟草种质幼苗样品侵染：将待鉴定烟草种质幼苗样品置于漂浮板孔洞中，将孢子悬浮液倒入鉴定装置透明筒中，再放入带有待鉴定烟草种质幼苗样品的漂浮板，并盖上遮光罩，25℃黑暗环境下侵染3h；-统计并鉴定结果：拿掉遮光罩，并将装置中的孢子悬浮液换成清水，25℃光照环境下培养5d后，统计烟苗发病情况，并根据统计结果鉴定烟草黑胫病抗性情况。进一步地，所述的一种烟草黑胫病抗性鉴定方法，还包括待鉴定样品选择：烟草播种，待烟草种质幼苗生长至小十字期，移栽至水培苗盘中，生长至大十字期的烟草种质幼苗可作为侵染样品。进一步地，所述燕麦培养基的配制方法为：称取燕麦33g倒入锅中，加入去离子水500ml，煮沸；煮至燕麦呈黏糊状后，用纱布过滤；取滤液，定容至1000ml；加入18g琼脂；灭菌即制得燕麦培养基。进一步地，所述培养皿的培养基中接种黑胫病菌的方法为：用打孔器在一皿黑胫病中打孔，使用牙签将黑胫病菌放在燕麦培养基的中心位置，便于菌的生长。进一步地，所述待鉴定烟草种质幼苗样品侵染的方法还包括：如需精确进行各部位的接种，使用支架将漂浮板高度进行固定，并调节孢子悬浮液深度使其浸泡至烟苗根尖、根毛、主根或根茎连接处。一种烟草黑胫病抗性鉴定装置，包括透明筒、漂浮板和遮光罩，所述透明筒用于盛放孢子悬浮液和清水，所述漂浮板表面开设有若干孔洞，所述漂浮板周侧面设有与孔洞相通的开口槽，所述孔洞和开口槽用于夹持待鉴定烟草种质幼苗样品。进一步地，所述的一种烟草黑胫病抗性鉴定装置，还包括支架，所述支架为圆筒状。本发明具有以下有益效果：本发明采用水培烟苗进行抗性鉴定，鉴定的过程也在水培环境中进行，保持了植株根部的完整性，防止根部损伤的不均衡造成的实验误差，且有助于观察发病情况与发病过程。本发明通过对黑胫病菌的活化体系及其孢子悬浮液诱导体系的精准控制，能够精确控制孢子悬浮液的浓度及活力，精确控制接种强度，增强鉴定种质抗性的准确度。本发明利用黑胫病主要侵染烟草根部和茎基部的特性，通过漂浮板配合支架接种，可以调节烟苗浸入孢子悬浮液的深度，从而能够准确控制接种部位。本发明的孢子悬浮液诱导方法快速且高效，孢子活力强，能够在第5天观察到烟草种质黑胫病抗性的差异，鉴定效率高。本发明操作简单快捷，通过遮光罩控制黑胫病菌的侵染环境（光照、湿度），并控制接种温度，提高了侵染效率，节省了鉴定时间。本发明通过每个漂浮板设置孔洞，用于抗病性鉴定对照及重复，孔旁边设置凹槽，便于将烟苗放入且避免对植株造成损伤。当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明一种烟草黑胫病抗性鉴定方法的步骤流程图。图2为本发明一种烟草黑胫病抗性鉴定装置的漂浮板的结构示意图。图3为本发明一种烟草黑胫病抗性鉴定装置的支架的结构示意图。图4为本发明一种烟草黑胫病抗性鉴定装置的透明筒、漂浮板和遮光罩的结构示意图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。如图1所示，本发明的一种烟草黑胫病抗性鉴定方法，包括以下步骤：一、待鉴定样品选择：烟草播种，待烟草种质幼苗生长至小十字期，移栽至水培苗盘中，生长至大十字期的烟草种质幼苗可作为侵染样品。二、黑胫病菌活化：配制燕麦培养基：称取燕麦33g倒入锅中，加入去离子水500ml，煮沸；煮至燕麦呈黏糊状后，用纱布过滤；取滤液，定容至1000ml；加入18g琼脂；灭菌即制得燕麦培养基；在每个一次性培养皿中倒入25mL培养基；在培养皿的培养基中接种黑胫病菌：用打孔器在一皿黑胫病中打孔，使用牙签将黑胫病菌放在燕麦培养基的中心位置，便于菌的生长；将接好菌的培养皿进行封口，标记号类型、日期；放置于28℃培养箱中；培养7d进行活化；用培养至第7d的烟草黑胫病均进行扩繁，28℃培养至14d，进行孢子悬浮液制备。三、孢子悬浮液制备：在黑胫病菌培养皿中加入15mL灭菌后0.1%的硝酸钾溶液；4℃黑暗培养20min；25℃光照培养25min；再将培养皿中液体移入50mL离心管中；通过血球计数板统一孢子悬浮液浓度至1×104个mL。四、待鉴定烟草种质幼苗样品侵染：将待鉴定烟草种质幼苗样品置于漂浮板孔洞中，将孢子悬浮液倒入鉴定装置透明筒中，再放入带有待鉴定烟草种质幼苗样品的漂浮板，并盖上遮光罩，25℃黑暗环境下侵染3h；如需精确进行各部位的接种，使用支架将漂浮板高度进行固定，并调节孢子悬浮液深度使其浸泡至烟苗根尖、根毛、主根或根茎连接处。五、统计并鉴定结果：拿掉遮光罩，并将装置中的孢子悬浮液换成清水，25℃光照环境下培养5d后，统计烟苗发病情况，并根据统计结果鉴定烟草黑胫病抗性情况。如图2-4所示，本发明的一种烟草黑胫病抗性鉴定装置，包括透明筒、漂浮板和遮光罩，透明筒用于盛放孢子悬浮液和清水，漂浮板表面开设有孔洞，漂浮板周侧面设有与孔洞相通的开口槽，开口槽数量为6个，并且呈圆周阵列开设，孔洞和开口槽用于夹持待鉴定烟草种质幼苗样品。其中，还包括支架，如图3所示，支架为圆筒状，可用于支撑漂浮板。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

权利要求：1.一种烟草黑胫病抗性鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：-黑胫病菌活化：配制燕麦培养基，并在每个一次性培养皿中倒入25mL培养基；在所述培养皿的培养基中接种黑胫病菌；将接好菌的培养皿进行封口，标记号类型、日期；放置于28℃培养箱中；培养7d进行活化；用培养至第7d的烟草黑胫病菌进行扩繁，28℃培养至14d，进行孢子悬浮液制备；-孢子悬浮液制备：在黑胫病菌培养皿中加入15mL灭菌后0.1%的硝酸钾溶液；4℃黑暗培养20min；25℃光照培养25min；再将培养皿中液体移入50mL离心管中；通过血球计数板统一孢子悬浮液浓度至1×104个mL；-待鉴定烟草种质幼苗样品侵染：将待鉴定烟草种质幼苗样品置于漂浮板孔洞中，将孢子悬浮液倒入鉴定装置透明筒中，再放入带有待鉴定烟草种质幼苗样品的漂浮板，并盖上遮光罩，25℃黑暗环境下侵染3h；-统计并鉴定结果：拿掉遮光罩，并将装置中的孢子悬浮液换成清水，25℃光照环境下培养5d后，统计烟苗发病情况，并根据统计结果鉴定烟草黑胫病抗性情况。2.根据权利要求1所述的一种烟草黑胫病抗性鉴定方法，其特征在于，还包括待鉴定样品选择：烟草播种，待烟草种质幼苗生长至小十字期，移栽至水培苗盘中，生长至大十字期的烟草种质幼苗可作为侵染样品。3.根据权利要求1所述的一种烟草黑胫病抗性鉴定方法，其特征在于，所述燕麦培养基的配制方法为：称取燕麦33g倒入锅中，加入去离子水500ml，煮沸；煮至燕麦呈黏糊状后，用纱布过滤；取滤液，定容至1000ml；加入18g琼脂；灭菌即制得燕麦培养基。4.根据权利要求1所述的一种烟草黑胫病抗性鉴定方法，其特征在于，所述培养皿的培养基中接种黑胫病菌的方法为：用打孔器在一皿黑胫病中打孔，使用牙签将黑胫病菌放在燕麦培养基的中心位置。5.根据权利要求1所述的一种烟草黑胫病抗性鉴定方法，其特征在于，所述待鉴定烟草种质幼苗样品侵染的方法还包括：如需精确进行各部位的接种，使用支架将漂浮板高度进行固定，并调节孢子悬浮液深度使其浸泡至烟苗根尖、根毛、主根或根茎连接处。6.一种烟草黑胫病抗性鉴定装置，其特征在于，包括透明筒、漂浮板和遮光罩，所述透明筒用于盛放孢子悬浮液和清水，所述漂浮板表面开设有若干孔洞，所述漂浮板周侧面设有与孔洞相通的开口槽，所述孔洞和开口槽用于夹持待鉴定烟草种质幼苗样品。7.根据权利要求6所述的一种烟草黑胫病抗性鉴定装置，其特征在于，还包括支架，所述支架为圆筒状。

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