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申请/专利权人：金银鹏;傅青春

摘要：本发明提供一种人干细胞来源的外泌体的冻干制剂，所述冻干制剂包含人干细胞，特别是人脂肪干细胞来源的外泌体以及海藻糖。本发明的冻干制剂在长期储存后，外泌体蛋白的测得量能够保持恒定。本发明的脂肪干细胞来源的外泌体的冻干制剂易于运输和长期储存；并且对机体安全，从而为今后的外泌体保存与应用提供了极大的便利。

主权项：1.一种人脂肪干细胞来源的外泌体的冻干制剂的再水化物，其特征在于，所述人脂肪干细胞来源的外泌体的冻干制剂包含人脂肪干细胞来源的外泌体以及浓度为10wt%的海藻糖；所述再水化物用5.6-6.3%的羟乙基淀粉溶液，在37℃下制得。

全文数据：人脂肪干细胞来源的外泌体冻干粉及其制备方法和应用技术领域本发明涉及干细胞及生物医药领域。具体地说，本发明涉及人源脂肪干细胞Human-AdiposeDerivedStemCell，hADSC来源的外泌体的冻干粉及其制备方法和应用。背景技术脂肪干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，具有免疫抑制、抗炎及促进增殖等多种作用，在心脏、肝脏、肾脏、大脑等多种疾病模型中展现出显著的疗效。脂肪干细胞可通过旁分泌途径分泌外泌体，在多种组织间起到信息传递作用。外泌体是一种细胞主动分泌的大小均一、直径为50-200nm的脂质双分子层结构囊泡，可由间充质干细胞、肿瘤细胞、树突细胞、成纤维细胞等多种不同类型细胞释放。外泌体中包含大量蛋白质、RNA、以及DNA等物质，对细胞间信息交流起到重要作用。脂肪干细胞外泌体拥有与脂肪干细胞相似的免疫抑制、抗炎等生物学效应。由于外泌体体积小、安全性高等优势，干细胞外泌体的移植应用于在心脏、肝脏、肾脏、大脑等多种组织领域。随着外泌体领域的发展，外泌体的安全保存非常重要。目前传统的外泌体保存方法是直接冻存于-80℃条件下。外泌体在冷冻状态下可短暂保存，但随着保存时间的延长，外泌体的双分子膜逐渐破碎，活性大幅度丧失，难以用于实验及临床应用。因此，本领域急需一种能够稳定保存干细胞，特别是脂肪干细胞来源的外泌体的方法。发明内容本发明的目的在于提供一种能够稳定保存干细胞，特别是脂肪干细胞来源的外泌体的技术手段以及获得的脂肪干细胞来源外泌体的冻干制剂，例如冻干粉末。在第一方面，本发明提供一种人干细胞来源的外泌体的冻干制剂，所述冻干制剂包含人干细胞来源的外泌体以及海藻糖。在优选的实施方式中，所述冻干制剂是冻干粉末。在优选的实施方式中，所述人干细胞是人脂肪干细胞。在具体的实施方式中，所述冻干制剂是通过以下方法制得：1将外泌体的溶液与海藻糖的溶液混合得到二者的混合溶液；2将步骤1所得的混合溶液冻干，从而得到所述的冻干制剂。在优选的实施方式中，所述外泌体的溶液与海藻糖的溶液等体积混合。在优选的实施方式中，所述外泌体的溶液与海藻糖的溶液混合，优选等体积混合后，海藻糖的终浓度为10wt％。在优选的实施方式中，步骤2的冻干可以是生物技术领域或化学领域常规的冻干方法。在具体的实施方式中，相比于储存前的原始外泌体蛋白测得量，所述冻干制剂在室温下，例如25-25℃下储存4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月后，外泌体蛋白测得量高于95％、96％、97％、98％、甚至高于99％。在第二方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第一方面所述的冻干制剂和任选的药学上可接受的赋形剂。在第三方面，本发明提供一种人干细胞来源的外泌体的冻干制剂的再水化物，其特征在于，所述人干细胞来源的外泌体的冻干制剂是第一方面所述的冻干制剂。在优选的实施方式中，所述再水化物用5.6-6.3％，优选5.9-6.2％，最优选6.0％的羟乙基淀粉溶液，优选在37℃下制得。在第四方面，本发明提供一种治疗用试剂盒，所述试剂盒装有：1第一方面所述的冻干制剂或权利要求4所述的药物组合物；25.6-6.3％，优选5.9-6.2％，最优选6.0％的羟乙基淀粉溶液；和3利用2所述的羟乙基淀粉溶液使得1所述的冻干制剂或药物组合物再水化并将得到的再水化物给予有此需要的对象的使用说明书。在第五方面，本发明提供第一方面所述的人干细胞来源的外泌体的冻干制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：1将外泌体的溶液与海藻糖的溶液混合得到二者的混合溶液；2将步骤1所得的混合溶液冻干，从而得到所述的冻干制剂。在优选的实施方式中，所述外泌体的溶液与海藻糖的溶液等体积混合。在优选的实施方式中，所述外泌体的溶液与海藻糖的溶液混合，优选等体积混合后，海藻糖的终浓度为10wt％。在优选的实施方式中，步骤2的冻干可以是生物技术领域或化学领域常规的冻干方法。在优选的实施方式中，所述人干细胞是人脂肪干细胞。在优选的实施方式中，所述冻干制剂是冻干粉末。在第六方面，本发明提供第三方面所述的人干细胞来源的外泌体的冻干制剂的再水化物的制备方法，其特征在于，用5.6-6.3％，优选5.9-6.2％，最优选6.0％的羟乙基淀粉溶液，优选在37℃下再水化第一方面所述的人干细胞来源的外泌体的冻干制剂，从而制备所述再水化物。在第七方面，本发明提供第一方面所述的人干细胞来源的外泌体的冻干制剂或第三方面所述的人干细胞来源的外泌体的冻干制剂的再水化物在制备药物中的用途。在具体的实施方式中，所述药物是治疗急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化，优选急性肝衰竭的药物。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文如实施例中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了冻存的hASC及hASC冻干粉的细胞形态。图2比较了外泌体及外泌体冻干粉的BCA-OD值。图3显示了外泌体及外泌体冻干粉的NTA粒径分布。图4显示了溶血性试验数据。图5显示了大鼠主动全身过敏性试验结果。图6显示了大鼠被动皮肤过敏性试验皮肤图片。图7显示了大鼠被动皮肤过敏性试验数据。具体实施方式发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现将脂肪干细胞来源的外泌体与海藻糖一起制成冻干制剂能够稳定地保存脂肪干细胞来源的外泌体；特别是脂肪干细胞来源的外泌体与海藻糖一起制成的冻干制剂在长期保存后的外泌体蛋白测得量恒定，从而本发明的外泌体冻干技术更适于长期保存。在此基础上完成了本发明。脂肪干细胞脂肪干细胞adipose-derivedstemcells，ADSC是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。它是来源于脂肪组织的一种间充质干细胞，可以分化为间质类细胞，如骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞等。ADSC细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。在优选的实施方式中，本文所述的脂肪干细胞是指人源脂肪干细胞。近年来，多潜能人源脂肪干细胞hADSC已成为治疗人类一些严重疾病，如脊髓损伤、脑卒中、急性肝衰竭等的很好的细胞来源。为了举例和方便的目的，本发明的实施例部分从人体抽脂术得到的脂肪组织中分离人源脂肪干细胞hADSC。但本领域公知，可以通过各种来源，包括但不限于商业来源获得人源脂肪干细胞hADSC。外泌体本文所述的“外泌体”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，是指活细胞分泌的具有脂质双分子层结构的小囊泡。这种外泌体在其表面表达有不同的标志蛋白。干细胞外泌体可通过携带大量包装过的蛋白质和RNA等，参与免疫调节、减轻炎症反应、促进血管生成、促进受损组织增殖以及细胞凋亡等。由于具有内在的靶向特性，可以将其内的蛋白质和RNA直接递送到受体细胞中；并且由于其为自然的细胞产物，可以避免受体巨噬细胞的吞噬作用或降解，避免胞内通路和溶酶体降解，从而在体内循环更长时间。此外，外泌体还可以穿透很多药物难以穿透的血脑屏障。因此，hASC外泌体可以从体外分离，递送到体内针对疾病进行治疗。外泌体的冻干与冻存随着干细胞外泌体研究的深入，外泌体的稳定储存也成了亟待解决的技术问题。目前外泌体多于-80℃条件下保存，因此，本文所述的“冻存”即是将外泌体直接保存在低温下，例如-80℃的冰箱中。但随着保存时间的延长，大部分外泌体会逐渐破碎，活性大幅度下降，严重影响实验及临床应用。本文所述的“冻干技术”即“冷冻干燥法”就是把含有大量水分的物质预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使固态水直接升华出来，而物质本身剩留在冻结时的冰架中，整个干燥是在较低的温度下进行的。因此，冷冻干燥对于许多热敏性的物质特别适用。而冻干粉作为一种固体干粉剂，能在常温下长期保存，性能稳定，输注方便，保存费用低廉。然而，生物膜的完整是外泌体冻干技术的最大障碍，由于低温和干燥对生物膜有较大损伤，外泌体在冻干过程中难免存在严重的膜破碎现象，导致活性下降。本发明人将人干细胞来源的外泌体与海藻糖一起制成冻干制剂完美解决了上述问题。例如，可以将将外泌体的溶液与海藻糖的溶液混合得到二者的混合溶液；再将得到的混合溶液冻干，从而得到所述的冻干制剂。其中采用的冻干方法可以是生物技术领域或化学领域常规的冻干方法。本发明的冻干制剂非常稳定，相比于储存前的原始外泌体蛋白测得量，所述冻干制剂在室温下，例如15-25℃下储存4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月后，外泌体蛋白测得量高于95％、96％、97％、98％、甚至高于99％。在本发明的人干细胞来源的外泌体的冻干制剂的基础上，本发明还提供包含所述冻干制剂和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，或治疗用试剂盒。本发明的冻干制剂可以进行再水化，所用的再水化溶液优选羟乙基淀粉溶液，例如5.6-6.3％，优选5.9-6.2％，最优选6.0％的羟乙基淀粉溶液。包含本发明的冻干制剂的药物组合物或药物可以用于治疗，例如急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化，优选急性肝衰竭。本发明的主要优点包括：1.本发明的脂肪干细胞来源的外泌体的冻干制剂稳定；2.本发明的脂肪干细胞来源的外泌体的冻干制剂易于运输和长期储存；和3.本发明的脂肪干细胞来源的外泌体的冻干制剂对机体安全，从而为今后的外泌体保存与应用提供了极大的便利。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。1.材料和方法1.1材料1.1.1实验试剂0.15％胶原酶IGibco，美国；DMEMF12培养基Hyclone，美国；胎牛血清Gibco，美国；0.25％胰蛋白酶Gibco，美国；BCA试剂盒Solarbio，中国；海藻糖国药，中国；羟乙基淀粉阿拉丁；人血白蛋白安博灵。1.1.2实验仪器恒温培养箱Thermo，美国；离心机TD25-WS，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；低温超速离心机Eppendorf，德国；粒度仪NS300，英国；超净工作台苏州安泰空气技术有限公司；超滤浓缩离心管Merk，爱尔兰；冻干机CHRIST。1.2实验方法1.2.1人脂肪干细胞的分离与培养抽脂术取健康人体颈部脂肪组织已签署知情同意协议书，PBS清洗3遍，加入0.1％胶原酶I于37℃水浴消化30min后置于离心机中，1200rmin离心5min后留取细胞沉淀，用适量PBS重悬后再次以上述条件离心，弃上清，加入含有体积分数为10％胎牛血清的DMEMF12培养基，接种于10cm培养皿，细胞浓度为1×106mL，置于37℃、体积分数为5％CO2饱和湿度培养箱中，48h后换液，观察细胞生长至80％时，加入0.25％胰酶消化后按1:3传代培养，培养至第3代留取后续实验使用。1.2.2人脂肪干细胞外泌体的提取取第3代人脂肪干细胞，首先用含有体积分数为10％胎牛血清的DMEMF12培养基培养，待其生长至80％以上时换用无血清的基础培养基继续培养24h，培养过程在37℃，体积分数为5％CO2的恒温温箱中进行；24h后将上清收集至离心管中，0.22μm的过滤器过滤后转移到100kd的超滤浓缩离心管中，4℃条件下以4000×g离心40min，得到富含外泌体的浓缩液，置于-80℃冰箱中储存备用。1.2.3人脂肪干细胞及外泌体冻干及再水化1.2.3.1人脂肪干细胞冻干及再水化将人脂肪干细胞消化离心，细胞沉淀与0.8M海藻糖负载液以体积比1:3制成细胞悬液，于37℃孵育6小时，细胞悬液与冻干保护剂20％人血白蛋白等体积混匀，37℃平衡30min，置于冻存盒中于-80℃预冻24h。冻干机冷阱温度-50℃，真空压力小于10mbar，冷冻干燥处理24小时，储存于4℃冰箱。再水化用温度为37℃的6％羟乙基淀粉溶液快速震荡溶解冻干粉。1.2.3.2外泌体冻干及再水化外泌体溶液与海藻糖溶液等体积混匀，使海藻糖终浓度为10wt％，37℃平衡30min，于-80℃预冻12h后置于冷冻机处理24h，冻干机冷阱温度-50℃，真空压力小于10mbar，冷冻干燥处理24小时，储存于4℃冰箱。再水化用温度为37℃的6％羟乙基淀粉溶液快速震荡溶解冻干粉。1.2.4人脂肪干细胞冻干粉形态学及流式细胞术检测分别将脂肪干细胞与脂肪干细胞冻干粉置于显微镜下，观察两组细胞数量及形态学差异。取人脂肪干细胞冻干粉再水化细胞，制成7管500ul单细胞悬液，分别加入抗人CD90-FITC、CD44-PE、CD105-PerCP、CD73-APC、无、阴性抗体群、阳性抗体群各2ul，37℃孵育30min后用PBS清洗3遍，使用流式细胞仪检测。1.2.5外泌体冻干粉检测1.2.5.1外泌体冻干粉BCA检测将外泌体分为等量两组，一组经冻干再水化，另一组不做特殊处理，分别将两组外泌体进行BCA蛋白含量检测，探索外泌体蛋白含量差异。1.2.5.2外泌体冻干粉NTA检测将外泌体与外泌体冻干粉分别制成1mL合适浓度溶液，利用NanosightNS300颗粒粒度分析仪检测外泌体样粉，将样品注入样粉槽，注满为止，调整软件参数使视频清晰，点开软件中的RUN键，收集数据。1.2.5.3外泌体冻干粉透射电子显微镜检测分别滴1滴约10μg外泌体或外泌体冻干粉于封口膜上，用镊子取1个铜网盖在液滴上5-10min，然后滴1滴2％磷钨酸染液于封口膜上，用镊子将铜网从外泌体液滴移到磷钨酸液滴上，染色3min，用滤纸吸干液体，放于白炽灯下烤干，用透射电镜观察并拍照。1.2.6外泌体冻干粉安全性检测1.2.6.1血管刺激性试验取2kg雄性家兔18只，随机分成6组，分别为EXO冻干粉组、EXO组、hASC冻干粉组、hASC组、生理盐水组、BSA阳性对照组5mgBSA，兔两侧耳静脉静脉滴注给药10ml，每日1次，连续3天，观察注射处附近有无红肿，血痂等。于末次给药24h后将兔放血处死，取双耳，用4％多聚甲醛溶液浸泡12h，距注射部位近心端1cm处，解剖取出静脉血管组织，纵向作病理切片，HE染色。家兔血管过敏性评价标准为：0级，给药部位无明显反应；1级，给药部位静脉血管轻度瘀血、红肿；2级，给药部位静脉血管中度瘀血、红肿；3级，给药部位静脉血管重度瘀血，周围组织严重红肿。病理学检查指标：静脉血管内皮细胞的完整度，有无充血、变性、坏死改变，基底膜是否完整，管壁及管周组织的完整情况等。1.2.6.2肌肉刺激性试验取2kg雄性家兔18只，随机分成6组，分别为EXO冻干粉组、EXO组、hASC冻干粉组、hASC组、生理盐水组、BSA阳性对照组5mgBSA，兔两侧股四头肌注射给药1ml，每日1次，连续3天，最后1次给药24h后肉眼观察注射部位及附近肌肉情况，再剪取肌肉组织离注射点1cm做病理切片HE。肌肉刺激反应分级标准：0级，无明显变化；1级，轻度充血，范围在0.5×1.0cm以下；2级，中度充血，范围在0.5×1.0cm以上；3级，重度充血伴有肌肉变性；4级，出现坏死，有褐色变性；5级，出现广泛性坏死。1.2.6.3体外溶血试验2kg雄性家兔1只，饲养3天后，颈总动脉取血约20ml，用缠有脱脂棉的木棒不断搅动血液，除去纤维蛋白原，使之成为脱纤血液。加入生理盐水约10倍量，摇匀，离心1500转15min，除去上清液，沉淀的红细胞用生理盐水按上述方法洗涤2次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用生理盐水配成体积分数为2％的混悬液，分为每管2.5ml。将EXO冻干粉组、EXO组、hASC冻干粉组、hASC组、生理盐水组、蒸馏水组分别加入到试管中，37℃温育，肉眼观察溶血与红细胞凝聚现象，3h后离心1500转15min，细胞沉淀重悬计数红细胞数，取上清液于545nm下测定吸光值。1.2.6.4主动全身过敏试验取雄性SD大鼠36只200g，随机分为12组：外泌体冻干粉高剂量组、外泌体冻干粉低剂量组、外泌体高剂量组、外泌体低剂量组、hASC高剂量组、hASC低剂量组、hASC冻干粉高剂量组、hASC冻干粉低剂量组、生理盐水组、BSA阳性对照组1mg、BSA阳性对照组5mg、BSA阳性对照组2.5mg。各组受试物与弗氏完全佐剂等体积混为悬浊液。致敏：隔日腹腔注射各组悬浊液1ml，共3次。激发：首次注射后的14天，每组取1只大鼠，静脉注射各组受试液1ml，观察半小时内豚鼠的表现。表现：-无症状；+不安、哆嗦、搔鼻、喷嚏、排尿、呼吸急促等；++除上述症状外，呼吸困难和运动障碍；+++除上述症状外，呼吸衰竭直至痉挛，但可恢复；++++死亡。1.2.6.5皮肤被动过敏试验取雄性SD大鼠12只200g，随机分为12组同上段分组，各组受试物与弗氏完全佐剂等体积混为悬浊液。致敏：隔日腹腔注射各组悬浊液1ml，共3次。首次致敏后14天后采血，制备抗血清。取雄性SD大鼠12只，将各组抗血清原液在动物背部脊柱两侧脱毛区皮内注射0.1mL点，2天后，各组动物进行抗原攻击：尾静脉注射1ml0.5ml抗原+0.5ml10％伊文斯蓝溶液激发抗原，30分后将动物处死，摘出背部皮肤，拍照并测量皮肤内侧的蓝色反应斑直径。实施例实施例1.冻存hASC及hASC冻干粉的形态观察结果如图1所示，其中：图A、B为冻干再水化的hASC的细胞形态；图C、D为冻干再水化的hASC培养24h后的细胞形态；图E、F为常规冻存hASC复苏时的细胞形态；图G、H为常规冻存hASC培养24h后的细胞形态，呈梭形紧密生长。可以看出，普通冻存的人脂肪干细胞复苏时，细胞饱满、呈圆球形，37℃培养24h后呈梭形贴壁生长。与普通冻存hASC相比，冻干再水化的hASC形态较不规则，数量较少，部分细胞成为碎片。培养24h，冻干再水化hASC均不贴壁，丧失细胞活性。实施例2.冻存EXO及EXO冻干粉的BCA蛋白含量比较结果如图2所示，其中：图A中5组样品分别标注为sample样品-1、sample-2、sample-3、sample-4、sample-5，每组样品初始外泌体等量；图B为BCA测得的外泌体冻干粉与外泌体冻存液在室温下20-25℃不同储存时间所测的蛋白含量。如图A所示，同组中EXO冻干粉的562nmOD值均略高于冻存EXO，即蛋白测得量较高。考虑为外泌体在冻干过程中有部分EXO双分子膜破碎，导致其中蛋白溢出，致蛋白测得值升高。图B显示，外泌体冻干粉的蛋白含量随时间延长减少不大，而外泌体冻存液蛋白含量随时间变化大幅度下降，考虑为外泌体蛋白裂解所致。实施例3.hASC外泌体及冻干粉的大小分布测定结果如图3所示，其中：A、B、C为外泌体的NTA数据；D、E、F为外泌体冻干粉再水化的NTA数据。。外泌体的直径多集中在130nm左右，外泌体冻干粉的粒径多集中150nm左右。EXO冻干粉的粒径较EXO稍大，考虑为EXO双分子膜在冻干的过程中可能丧失部分弹性，导致膜松弛，粒径变大。实施例4.hASC外泌体及冻干粉的血管刺激试验结果为：EXO冻干粉组、EXO组、hASC冻干粉组、hASC组与阴性对照生理盐水组给药部位均无明显反应，肉眼评价均为0级。从病理结果可以看出，EXO冻干粉组、EXO组、hASC冻干粉组、hASC组、生理盐水组内皮完整，均无充血、变性、坏死等，说明EXO冻干粉、EXO、hASC冻干粉、hASC均无血管刺激性。实施例5.hASC外泌体及冻干粉的肌肉刺激试验结果为：EXO冻干粉组、EXO组、hASC冻干粉组、hASC组与阴性对照生理盐水组内皮均完整，均无充血、变性、坏死等，评为0级，BSA组有中度充血，评为2级。说明EXO冻干粉、EXO、hASC冻干粉、hASC均无肌肉刺激性。实施例6.hASC外泌体及冻干粉的体外溶血试验结果如图4所示，其中：图A为试验结果照片，各试管依次为EXO冻干粉组、EXO组、hASC冻干粉组、hASC组、生理盐水组、蒸馏水组；图B为离心后各组上清的545nmOD值，每组3个样品；图C为重悬后红细胞计数。A图中，前5管上清清亮，细胞沉淀较多；第6管上清红染，沉淀较少，说明蒸馏水组有明显溶血现象，其他各组溶血均不明显图4-A。离心后各组取上清测545nmOD值，蒸馏水阳性组OD值较高，有明显溶血，其他组OD值均较低，溶血不明显图4-B。重悬后显微镜下进行红细胞计数，蒸馏水阳性组红细胞最少，其他组红细胞均明显高于蒸馏水组图4-C。以上结果均提示，EXO、EXO冻干粉、hASC、hASC冻干粉均不会造成大规模溶血。实施例7.hASC外泌体及冻干粉的主动全身过敏试验结果如图5所示，其中：1-12分别为外泌体冻干粉高剂量组、外泌体冻干粉低剂量组、外泌体冻存液高剂量组、外泌体冻存液低剂量组、hASC高剂量组、hASC低剂量组、hASC冻干粉高剂量组、hASC冻干粉低剂量组、生理盐水组阴性对照、BSA阳性对照组1mg、BSA阳性对照组2.5mg、BSA阳性对照组5mg，每组3只大鼠。结果显示，1-8组均呈阴性，10-12阳性对照组呈阳性。EXO、EXO冻干粉、hADC、hASC冻干粉主动全身过敏试验均呈阴性，未引起Ι型超敏反应，安全性可靠。实施例8.hASC外泌体及冻干粉的被动皮肤过敏试验结果如图6和7所示，其中：1-12分别为外泌体冻干粉高剂量组、外泌体冻干粉低剂量组、外泌体冻存液高剂量组、外泌体冻存液低剂量组、hASC高剂量组、hASC低剂量组、hASC冻干粉高剂量组、hASC冻干粉低剂量组、生理盐水组阴性对照、BSA阳性对照组1mg、BSA阳性对照组2.5mg、BSA阳性对照组5mg，尺子所测量为皮肤内最大蓝斑的最大直径；图7中的数据取自图6的尺子所测量的数据，为所测蓝斑最大直径。结果显示，1-8组皮肤蓝斑最大直径均小于10-12阳性对照组直径，说明EXO、EXO冻干粉、hADC、hASC冻干粉主动全身过敏试验均呈阴性，不会引起明显皮肤反应。对比例.hASC外泌体冻干粉的再水化过程本发明人进一步考察了再水化溶液的浓度以及在细胞的冷冻干燥方法中常用的各种其它再水化溶液，例如5％蔗糖、5％脱脂奶粉、5％纤维二糖和5％D-半乳糖对最终得到的hASC外泌体冻干粉的影响。发现采用其它再水化溶液得到的hASC外泌体冻干粉的效果明显不如本发明采用的羟乙基淀粉溶液；并且本发明的羟乙基淀粉溶液的浓度也需要维持在较小范围，例如5.6-6.3％，优选5.9-6.2％，最优选6.0％能够获得最佳的效果。讨论本发明人首先研究了脂肪干细胞的冻干效果。发现即便在海藻糖及人血白蛋白的保护下，脂肪干细胞经冻干再水化过程后，显微镜下显示细胞部分破碎，但仍有部分细胞具有细胞结构，但形态大小不规则，胞体欠丰满。经常规培养过夜之后，冻干再水化细胞均无贴壁现象。说明该条件下，脂肪干细胞经冻干再水化之后，虽可保持细胞形态，但丧失细胞活性。因此该冻干方法不适于脂肪干细胞的储存。外泌体表面及囊泡内富含大量蛋白质及RNA等物质，并通过这些蛋白及RNA发挥生物学效应，实验室可通过蛋白质的含量检测外泌体的含量。因此，虽然脂肪干细胞的冻干研究没有取得预料中的成功，但本发明人没有放弃，进而研究脂肪干细胞来源的外泌体的冻干效果。外泌体及外泌体冻干粉的BCA蛋白检测结果显示，同等数量外泌体经冻干保存比常规冻存蛋白含量测得值高。BCA试剂所测外泌体蛋白含量为外泌体表面所暴露的蛋白。冻干保存蛋白测得值较高疑为外泌体经冻干再水化处理之后，部分破裂，致囊泡内蛋白溢出，使BCA测得值升高。NTA结果显示外泌体经冻干再水化之后粒径稍大，但直径仍在50-200nm之内。疑为外泌体受冻干再水化影响，磷脂双分子膜原有结构及弹性丧失，致使外泌体形态不规则，较冻干前体积增大，但囊泡仍完整未破碎。以上结果均提示就短期保存来讲，冻干技术略逊于常规冻存技术，考虑到冻干操作本身比冻存操作更复杂，对设备的要求更高，相应的成本也更高，似乎将冻干技术应用于外泌体储存的前景不佳。然而，本发明人增加保存时间对冻干和冻存两种方法进行探索。分别于0、2、4、6、8、10、12月7个时间点对外泌体冻干粉及外泌体冻存液进行BCA蛋白含量测定，发现冻干技术储存的外泌体蛋白测得量恒定，而常规冻存储存的外泌体从2月开始蛋白测得量逐渐下降。综合来看，外泌体冻干技术更适于长期保存。由于本发明的冻干再水化过程加入海藻糖、羟乙基淀粉等物质，且外泌体经冻干再水化之后部分破碎、形态也有变化，所以外泌体经冻干之后的安全性需要评估。本研究对外泌体冻干粉、外泌体、脂肪干细胞冻干粉、脂肪干细胞分别进行了血管刺激性试验、肌肉刺激性试验、溶血性试验、主动全身过敏性试验、被动皮肤过敏性试验。结果显示，外泌体冻干粉、外泌体、脂肪干细胞冻干粉、脂肪干细胞均未引起阳性反应。脂肪干细胞及外泌体免疫原性低，不易引起免疫排斥反应，经冻干之后，脂肪干细胞及外泌体冻干粉的免疫原性未发现有升高现象。所以可得出结论，外泌体冻干粉、外泌体、脂肪干细胞冻干粉、脂肪干细胞均无血管、肌肉刺激性，不会引起溶血，可用于机体注射，主动全身过敏试验、被动皮肤过敏试验阴性说明未引起Ι型超敏反应，免疫原性低，安全性可靠。本研究所得外泌体冻干粉虽可引起外泌体引起外泌体部分破碎，形态也发生变化，但仍可保持大量外泌体的完整性，可长期保存，安全可靠。说明外泌体冻干技术有进一步探索利用的价值，或可通过改变冻干预处理条件达到更好的效果。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

权利要求：1.一种人干细胞来源的外泌体的冻干制剂，所述冻干制剂包含人干细胞来源的外泌体以及海藻糖。2.如权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，所述冻干制剂是通过以下方法制得：1将外泌体的溶液与海藻糖的溶液混合得到二者的混合溶液；2将步骤1所得的混合溶液冻干，从而得到权利要求1所述的冻干制剂。3.如权利要求1或2所述的冻干制剂，其特征在于，相比于储存前的原始外泌体蛋白测得量，所述冻干制剂在室温下，例如25-25℃下储存4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月后，外泌体蛋白测得量高于95％、96％、97％、98％、甚至高于99％。4.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-3中任一项所述的冻干制剂和任选的药学上可接受的赋形剂。5.一种人干细胞来源的外泌体的冻干制剂的再水化物，其特征在于，所述人干细胞来源的外泌体的冻干制剂是权利要求1-3中任一项所述的冻干制剂。6.一种治疗用试剂盒，所述试剂盒装有：1权利要求1-3中任一项所述的冻干制剂或权利要求4所述的药物组合物；25.6-6.3％，优选5.9-6.2％，最优选6.0％的羟乙基淀粉溶液；和3利用2所述的羟乙基淀粉溶液使得1所述的冻干制剂或药物组合物再水化并将得到的再水化物给予有此需要的对象的使用说明书。7.一种权利要求1-3中任一项所述的人干细胞来源的外泌体的冻干制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：1将外泌体的溶液与海藻糖的溶液混合得到二者的混合溶液；2将步骤1所得的混合溶液冻干，从而得到所述的冻干制剂。8.一种权利要求5所述的人干细胞来源的外泌体的冻干制剂的再水化物的制备方法，其特征在于，用5.6-6.3％，优选5.9-6.2％，最优选6.0％的羟乙基淀粉溶液，优选在37℃下再水化权利要求1-3中任一项所述的人干细胞来源的外泌体的冻干制剂，从而制备所述再水化物。9.权利要求1-3中任一项所述的人干细胞来源的外泌体的冻干制剂或权利要求5所述的人干细胞来源的外泌体的冻干制剂的再水化物在制备药物中的用途。10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述药物是治疗急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化，优选急性肝衰竭的药物。

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