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申请/专利权人：辉源生物科技(上海)有限公司

摘要：本发明公开一种稳定表达SMARCA2‑HiBiT或SMARCA4‑HiBiT融合蛋白的细胞系及其制备方法与应用，所述方法包括：针对SMARCA2和SMARCA4分别设计并合成SMARCA2‑sgRNA、SMARCA4‑sgRNA和DNA修复模板，使用RNP法将SMARCA2‑sgRNA、SMARCA2‑Donortemplate和Cas9蛋白共转染进入HT1080细胞，得到SMARCA2转染复合物，使用RNP法将SMARCA4‑sgRNA、SMARCA4‑Donortemplate和Cas9蛋白共转染进入HT1080细胞，得到SMARCA4转染复合物，进行单克隆培养并PCR测序验证。本发明基于CRISPR基因编辑技术将11个氨基酸的HiBiT标签引入到SMARCA2和SMARCA4蛋白基因的羧基端，构建了SMARCA2和SMARCA4的HiBiT敲入HT1080细胞系，建立了高效、灵敏、可量化和可重现的蛋白质降解技术平台，满足不同通量和不同研发阶段需求。

主权项：1.一种稳定表达SMARCA2-HiBiT或SMARCA4-HiBiT融合蛋白的细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、针对SMARCA2和SMARCA4分别设计并合成SMARCA2-sgRNA、SMARCA4-sgRNA和DNA修复模板，所述DNA修复模板包括SMARCA2-Donortemplate和SMARCA4-Donortemplate；步骤2、使用RNP法将SMARCA2-sgRNA、SMARCA2-Donortemplate和Cas9蛋白共转染进入HT1080细胞，得到SMARCA2转染复合物，使用RNP法将SMARCA4-sgRNA、SMARCA4-Donortemplate和Cas9蛋白共转染进入HT1080细胞，得到SMARCA4转染复合物；步骤3、将SMARCA2转染复合物和SMARCA4转染复合物分别加入到细胞培养基中，培养至少48h；步骤4、分别用含EDTA的胰蛋白酶消化细胞并计数，稀释细胞并培养7~10天，挑选单克隆生长的细胞克隆扩大培养，PCR扩增后将扩增产物进行Sanger测序验证，得到稳定表达SMARCA2-HiBiT和SMARCA4-HiBiT融合蛋白的细胞系。

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