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申请/专利权人：青岛大学附属医院

摘要：本发明公开了一种基于催化发夹组装循环反应和G四联体‑血红素DNA酶形成反应的生化传感体系，用于环状RNAcircRNA的光电化学比色检测。核酸探针H1与纳米磁珠MNPs结合后对circRNA特异性识别，形成MNPsH1circRNA复合物；再与探针H2反应形成MNPsH1H2复合物；利用限制性核酸内切酶切割，H1和H2探针被释放出一部分序列，未释放的序列与hemin结合，形成具有类过氧化物酶活性的G四联体‑血红素DNA酶；通过级联催化反应，反应体系的溶液颜色发生变化，拟合溶液吸光度与其中circRNA浓度的线性关系，开发出对circRNA进行光电化学比色检测的有效方法。

主权项：1.一种用于环状RNA光电化学比色检测的生化传感体系，具备如下显著特征：1利用特定的探针，通过催化发夹组装循环反应CHA对环状RNAcircRNA进行特异性识别；利用限制性核酸内切酶切割CHA的产物，然后再与血红素hemin结合形成G四联体-血红素DNA酶G-quadruplex-heminDNAzyme，实现信号的放大；最后通过比色方法检测，实现了对circRNA的定量测定；2连接在纳米磁珠MNPs表面的探针本体是对circRNA反向剪接位点BSJ序列具有特异性识别功能的特定核酸探针即H1，其核酸序列为5’-CACAAGCCTCCCTTTTGTTTTTCTGAAATTGAGAGTCAGAAAAACAAAAGGGCCGGGAGGGATGGGTT-3’，探针H1采用3’-端氨基化处理后与羧基化的MNPs组成探针MNPsH1；游离探针H2，其核酸序列为5’-GTTTTTCTGACTCTCAATTTCAGAAAAACAAAAGGGGAAATTGAGAGTC-3’，在目标检测物circRNA存在的条件下，游离探针H2与MNPsH1发生特异性识别作用，进而形成MNPsH1H2复合体系；3探针MNPsH1的制备：MNPs与偶联剂1-3-二甲基氨丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS混合，完成MNPs表面羧基的活化后与H1混合，过夜孵育，制备得到探针MNPsH1；4CHA的反应条件：按1:1:1:1的体积比依次量取探针MNPsH1、目标检测物circRNA、H2分散液和磷酸盐缓冲液PBS缓冲液，均匀混合后在37℃下反应，通过磁分离处理混合体系得到CHA反应产物；该产物具备如下特征，即探针MNPsH1与circRNA的BSJ序列通过碱基互补配对结合后形成MNPsH1BSJ复合物，探针H1的发夹结构因此被打开，探针H2与探针H1的识别位点暴露，二者相互结合，进而释放出circRNA，形成CHA反应产物与MNPsH1H2的复合物；5G-quadruplex-heminDNAzym的形成反应：在限制性核酸内切酶的作用下，MNPsH1H2复合物中的探针H1和H2的部分序列被释放出来，而探针H1靠近3’端的序列依然保留在MNPs上，随后与hemin溶液结合，形成具有类过氧化物酶活性的G-quadruplex-heminDNAzyme结构；6circRNA的测定：将表面结合了一定量G-quadruplex-heminDNAzyme的MNPs与3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB和过氧化氢H2O2混合，加入目标检测物circRNA后进行反应；基于所形成混合反应体系的吸光度与其中的circRNA浓度的对数，采用线性拟合制作标准曲线，从而实现对circRNA的光电化学比色检测。

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