买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：福建医科大学附属协和医院

摘要：本发明公开一种基于血液骨髓样本液基细胞制片术的红细胞数量梯度溶血素法用于细胞形态及免疫标记观察，步骤为：测试样本红细胞计算；根据红细胞数量范围确定溶血素用量；溶血后样本洗涤及液基细胞制片机制片和染色观察，取计算所得样本量加入流式细胞管中，加PBS补充容量，加免疫荧光探针，震荡混匀，室温孵育后，加入溶血素，沉淀免疫荧光探针标记的细胞及部分红细胞，并移除上清液；去除未结合免疫荧光探针及红细胞碎片，得到免疫荧光探针‑细胞偶联物；加PBS，通过离心力将免疫荧光探针‑细胞偶联物移至粘附型玻片上，于室温下晾干；滴用瑞氏瑞‑姬氏染液复染，冲洗，室温晾干，可用于显微镜下细胞形态及标记观察和图像采集。

主权项：1.一种基于血液骨髓样本液基细胞制片术的红细胞数量梯度溶血素法在细胞形态及免疫标记观察中的应用，包括如下步骤：（1）测试样本红细胞计算在涂片形态学观察细胞时，选择血液骨髓的血膜体尾交界处细胞分布均匀染色良好区域，此处细胞中的红细胞、白细胞比较分散，细胞能充分伸展，胞核、胞浆、核仁细胞结构染色清晰，高倍镜HP下白细胞分布10-20之间；采用液基制片法要达到白细胞10-20HP分布要求，每一份血液骨髓样本白细胞含量需在10-20万之间；血液骨髓样本中的白细胞浓度以4.0*109L起始浓度计算，血液骨髓样本加入的红细胞数量不会超过23*107；当血液骨髓样本中的白细胞浓度为4.0*109L，红细胞浓度为4.5*1012L，加入20万个白细胞有核细胞时，加入的样本量为：2000004000μL=50μL，则加入的测试样本中红细胞数量计算方法为，50*4.5*106=220*106=22*107；（2）根据红细胞数量范围确定溶血素用量保留一定数量的红细胞可提高观察样本中白细胞的染色质量，样本洗涤过程中少量红细胞存在可指示操作过程，做白细胞免疫标记时，红细胞的存在可作为阴性背景辅助判断标记的质量；样本中红细胞的溶解程度与加入的溶血素量及溶解时间相关，不同数量红细胞的样本中裂解后若要保留适当数量的红细胞则需要控制溶血素的用量，具体为：根据样本中包含的成熟红细胞数量梯度使用溶血素分5个梯度，样本中红细胞数量为18*107-23*107时，溶血素2ml,溶血时间3分钟，红细胞数量在＜18*107，≥12*107时，溶血素用量1.5ml,溶血时间3分钟，红细胞数量在＜12*107，≥7*107时，溶血素用量1.0ml,溶血时间3分钟，红细胞数量在＜7*107，≥1.1*107时，溶血素用量0.5ml,溶血时间3分钟，红细胞数量＜1.1*107时，无需使用溶血素溶血；（3）溶血后样本洗涤及液基细胞制片机制片和染色观察样本中白细胞及红细胞浓度通过血细胞计数仪测定或通过改良牛鲍计数板法计数白细胞有核细胞及红细胞的含量，取计算所得样本量加入流式细胞管中，加PBS补充容量至100μL，加入20μL免疫荧光探针，震荡混匀，室温孵育30分钟；孵育结束后，加入溶血素，震荡混匀，室温静置3分钟，2000rpm，离心5分钟，沉淀免疫荧光探针标记的细胞及部分红细胞，并移除上清液；沉淀中加入2mLPBS，震荡吹打混匀，2000rpm，离心5分钟，移除上清，此清洗-离心步骤重复3次，去除未结合免疫荧光探针及红细胞碎片，得到免疫荧光探针-细胞偶联物；加入1mLPBS，震荡混匀，并将1mL免疫荧光探针-细胞偶联物转移到离心制片机的沉降槽中，通过离心力将免疫荧光探针-细胞偶联物移至粘附型玻片上，玻片于室温下晾干；然后在干燥的粘附玻片上滴用瑞氏瑞-姬氏染液复染20~30分钟，流水冲洗30~45s，室温下晾干，可用于显微镜下细胞形态及标记观察和图像采集。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 福建医科大学附属协和医院 基于红细胞数量梯度溶血素法用于血液/骨髓样本液基细胞制片术细胞形态及免疫标记观察