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申请/专利权人：大连理工大学

摘要：本发明公开了一种提高CRISPRCas基因编辑效率的方法，属于基因工程技术领域。首先将pCas质粒及pTox质粒转入宿主菌，pCas质粒中插入有Cas基因和lambdaRed基因，pTox质粒中插入有毒性基因，再将pgRNA质粒与外源DNA共同转入上述宿主菌，pgRNA质粒中插入有靶向目标基因gRNA_1和靶向pTox质粒的抗性基因的gRNA_2；pCas质粒表达的Cas蛋白与pgRNA质粒转录的gRNA_1组合对目标靶向位点进行DNA剪切，lambdaRed系统结合外源DNA实现基因重组，Cas蛋白与gRNA_1组合后未对目标靶向位点进行DNA剪切，宿主菌中pTox质粒表达有毒物质，从而去除未经基因编辑的宿主菌，保留经基因编辑的宿主菌。此方法不仅可提高单个靶向位点的基因编辑效率，也能提高基因敲除、大片段DNA插入及重组效率，提高高通量基因编辑的效率。

主权项：1.一种提高CRISPRCas基因编辑效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将pCas质粒及pTox质粒转入宿主菌中，所述的pCas质粒中插入有Cas基因和lambdaRed系统基因，所述的pTox质粒中插入有毒性基因；（2）再将pgRNA质粒与外源DNA转入步骤（1）得到的宿主菌中，pgRNA质粒中插入有靶向目标基因gRNA_1和靶向pTox质粒的毒性基因的gRNA_2，gRNA_2的前端插入有SOS响应基因启动子，SOS响应基因启动子由pCas质粒表达的Cas蛋白与pgRNA质粒转录的gRNA_1组合后对目标靶向位点进行DNA剪切来启动；（3）pCas质粒表达的Cas蛋白与pgRNA质粒转录的gRNA_1组合对目标靶向位点进行DNA剪切，pCas质粒表达的lambdaRed系统结合外源DNA实现基因重组，在培养过程中去除未经基因编辑的宿主菌，保留经基因编辑的宿主菌；步骤（1）中所述的宿主菌为大肠杆菌；步骤（1）中所述的Cas为Cas9、AsCas12a、LbCas12a、MAD7或FnCas12a；步骤（1）中所述的毒性基因为硝基还原酶基因nfsI或果聚糖蔗糖转移酶基因sacB；步骤（2）中所述的gRNA_2的核苷酸序列如SEQIDNO.5或SEQIDNO.6所示；步骤（2）中SOS响应基因为recA、uvrD、recG、rnhA、dam、xerC、ftsK、priA、dnaT、polA或lexA。

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百度查询： 大连理工大学 一种提高CRISPR/Cas基因编辑效率的方法