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申请/专利权人：江苏创健医疗科技股份有限公司

摘要：本发明公开了一种酵母表达三螺旋结构Ⅰ型重组人胶原蛋白的制备方法及其应用，涉及生物技术领域。该制备方法包括利用工程菌发酵纯化得到该三螺旋结构Ⅰ型重组人胶原蛋白的步骤；该工程菌的构建方法包括将pMChZ‑α1Ⅰ、pMCrN‑α2Ⅰ、pPIC9K‑P4HDP‑1和pMCeH‑[α1Ⅰ]2α2Ⅰ质粒转化宿主菌，构建得到该工程菌的步骤。利用该制备方法制备得到的具有三螺旋结构的Ⅰ型重组人胶原蛋白含有羟脯氨酸，羟脯氨酸达到总脯氨酸的30％以上。从而可以使得Ⅰ型重组人胶原蛋白能够广泛用于化妆品、医学美容、医疗器械、生物医学材料等领域，具有很好的实用性和重要的市场应用价值。

主权项：1.一种表达三螺旋结构Ⅰ型重组人胶原蛋白的工程菌的构建方法，其特征在于，包括将pMChZ-α1Ⅰ质粒、pMCrN-α2Ⅰ质粒、pPIC9K-P4HDP-1质粒和pMCeH-[α1Ⅰ]2α2Ⅰ-质粒转化宿主菌，构建得到所述工程菌的步骤；所述pMChZ-α1Ⅰ质粒是将α1Ⅰ克隆到pMChZ-AOX载体得到；所述pMCrN-α2Ⅰ质粒是将α2Ⅰ克隆到pMCrN-AOX载体得到；所述pPIC9K-P4HDP-1质粒是将P4H9KDP质粒中的KanR替换为如SEQIDNO.12所示的序列得到；所述pMCeH-[α1Ⅰ]2α2Ⅰ质粒是将[α1Ⅰ]2α2Ⅰ转录单元克隆到pMCeH-AOX载体得到；所述α1Ⅰ的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述α2Ⅰ的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述[α1Ⅰ]2α2Ⅰ转录单元核苷酸序列如SEQIDNO.13所示；所述pMChZ-AOX载体是对pPIC9K质粒进行如下改造得到：以核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的DNA分子替代所述pPIC9K质粒的4648-9221bp；将所述pPIC9K质粒中位于αMF上游的BamHⅠ删除；在所述pPIC9K质粒的1583-1584bp间通过点突变引入BamHⅠ识别位点；所述pMCrN-AOX载体是以核苷酸序列如SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示的DNA分子分别替代所述pMChZ-AOX质粒上的PpHIS4和Zeocin筛选标记而构建得到；所述pMCeH-AOX载体是以核苷酸序列如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示的DNA分子分别替代所述pMChZ-AOX质粒上的PpHIS4和PEM7-BleoR-CYC1tt而构建得到。

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