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申请/专利权人：广西医科大学

摘要：目前肝癌是高发癌种且在免疫治疗中响应率不高，本发明设计了一种基于树突状细胞DC和γδT细胞来源囊泡的新型纳米反应器，利用免疫细胞囊泡良好的生物相容性的固有特性以及具有调动先天免疫和适应性免疫反应的特点，以重塑肿瘤局部免疫耗竭状态。纳米囊泡通过修饰SP94靶向肽的递送作用精准到达肝癌局部，释放其中装载的葡萄糖氧化酶GOx并消耗肿瘤内葡萄糖和O2产生葡萄糖酸和H2O2，为乏氧激活的前药替拉扎明TPZ制造缺氧环境，最终激活TPZ对肝癌细胞的杀伤作用。

主权项：1.一种双免疫细胞源性囊泡的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1，实验试剂配制的准备：准备好如下实验试剂配制：1×PBS，1×红细胞裂解液，DC专用培养基：1640培养基中含人重组GM-CSF100ngmL和IL-4100ngmL，完全培养基164015％FBS，1mgmLGOx和TPZ；步骤2，人外周血单个核细胞PBMC提取：1使用EDTA-K2真空采血管，抽取40-50mL健康人外周血，将抽取的外周血用无菌1×PBS溶液进行1：1.5倍比例稀释，充分混匀；2取10-12支15mL无菌离心管，每支离心管的管底用巴氏吸管加入3-4mLFicoll淋巴细胞分离液；3在15mL离心管中，每管加入6-8mL稀释混匀后的外周血；4将离心管转移至离心机中，2500rpm，4℃离心20min；5取出离心管，此时液体分为四层，从上至下依次为：血浆和血小板层、单个核细胞层、分离液层、多型核白细胞和红细胞层，单个核细胞层呈现为白膜状，用巴氏吸管将白膜层吸出后收集至无菌50mL离心管中；6在装有白膜层的离心管中加入白膜层液体2倍体积的1×PBS溶液，充分混匀，转移至离心机中，2500rpm，室温离心10min；弃去上清后，加入5mL红细胞裂解液混匀，室温5min，裂解残余红细胞后，加入15mL1×PBS溶液终止裂解；7离心管转移至离心机中，1500rpm，室温离心5min，弃去上清，细胞沉淀使用1640培养基进行重悬混匀，得到外周血单个核细胞PBMC；步骤3，体外诱导培养人源性DC细胞：1第0天，按照2-3×106个细胞mL细胞密度在步骤2中得到的PBMC中加入20-25mL的1640基础培养基，轻柔混匀后铺入6孔细胞培养板中，每孔3mL细胞悬液；2将细胞培养板置入37℃的CO2培养箱中静置孵育2h，待细胞贴壁，弃去孔板中上清液及其中悬浮细胞，加入GM-CSF为100ngmL、IL-4为100ngmL的DC培养基，然后置入37℃的CO2培养箱中孵育3天；3第4天使用巴氏吸管将六孔板中细胞悬液轻柔吹打3-4次，收集至50mL离心管中，置入离心机，1000rpm，室温离心5min后弃去上清，加入9mL的DC培养基，轻柔混匀，滴加细胞悬液至新的6孔细胞培养板中，置入37℃的CO2培养箱中孵育2天；4第6天加入50mgmL肿瘤细胞裂解肽进入细胞培养板中，置入37℃的CO2培养箱中孵育2天；5第8天，将细胞悬液收集至无菌15mL离心管中，置入离心机，1000rpm，离心3min后弃去上清，加入1×PBS溶液使细胞密度达到5×106个细胞mL，得到人源性DC细胞悬液；步骤4，体外诱导培养γδT细胞：1第0天，使用1640完全培养基15％FBS将步骤2中得到的PBMC调整细胞密度达到3×106个细胞mL，然后加入如下体积的药物和细胞因子：ZOL为1μLmL、IL-2为4μLmL、IL-15为1μLmL、维生素C为1μLmL，置入37℃的CO2培养箱中孵育三天；2第5天，使用巴氏吸管将细胞悬液收集至50mL离心管中，置入离心机，600rpm,室温离心7min，弃去上清后，按照3×106个细胞mL的细胞密度加入1640完全培养基10-15mL，然后加入如下药物和细胞因子：IL-2为1μLmL,IL-15为1μLmL、维生素C为1μLmL，使用巴氏吸管充分混匀后，加入至新的T25培养瓶中放入37℃的CO2培养箱中孵育三天；3第13天，收集培养瓶中细胞并更换新鲜1640完全培养基，加入如下药物和细胞因子：IL-2为1μLmL,IL-15为1μLmL、维生素C为1μLmL，更换新培养瓶并继续放入37℃的CO2培养箱中孵育1天4第14天，得到人源性γδT细胞悬液；步骤5，免疫细胞外囊泡的制备：1将DCγδT细胞悬液收集至50mL离心管中，置入离心机，1000rpm，室温离心3min；2弃去上清后，加入2-5mL1×PBS溶液，充分混匀；3取10μL细胞悬液，加入10μL台盼蓝溶液混匀，按照5×106个细胞mL的密度重悬细胞；4装置LF-1脂质体挤推器，1×PBS反复挤推7-8次润洗注射器；每次加入1mL细胞悬液，反复挤推18-20次，依次通过5.0μm、400nm、200nm的聚碳酸酯膜，收集至2mL无菌EP管中，冰上保存；5提前预冷离心机至4℃，300g，离心5min，调节转速为16500g，离心20min，收集上清液，使用0.22μm过滤器过滤至新离心管中制备成DCEVs和γδTEVs，-20℃保存；步骤6，负载GOxTPZ的靶向性双免疫细胞源性囊泡的制备：1将DCEVs溶液与1mgmLTPZ溶液充分混匀，γδTEVs与1mgmLGOx溶液充分混匀，设置超声细胞破碎仪振幅为20％，超声工作30s，静置冷却2min，持续6个循环，室温孵育1h；2使用LF-1脂质体挤推器，反复挤推18-20次，并收集初步制备的载药囊泡于超滤管中；3置入离心机中，10000g，4℃离心20min，去除游离的TPZGOx药物；4用1mL1×PBS溶液重悬超滤管上层中的沉淀并收集至EP管中；5按照1mL载药囊泡：200μL的SP94靶向肽，冰上孵育10min，加入超滤管后置入离心机中，10000g，4℃离心20min，去除未结合的靶向肽，将纯化后的SP94-DCEVs@TPZ和SP94-γδTEVs@GOx于-20℃中保存，得到负载GOxTPZ的靶向性双免疫细胞源性囊泡。

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百度查询： 广西医科大学 一种双免疫细胞源性囊泡的制备方法及其应用