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申请/专利权人：江苏省农业科学院

摘要：本发明涉及用于防控小麦茎基腐病的基因片段及其应用。其中，假禾谷镰孢菌Fp487基因序列如SEQIDNO.1所示，经实验证实，该基因是防控小麦茎基腐病的关键靶点基因，针对该基因实施基因沉默可以有效防控假禾谷镰孢菌导致的小麦茎基腐病。用于防控小麦茎基腐病的基因片段序列如SEQIDNO.3所示，以该基因片段为靶标合成的dsRNA可用于防控小麦茎基腐病，同时本发明能高效合成该dsRNA。本发明以假禾谷镰孢菌Fp487基因为基础，合成获得的dsRNA能有效降低病菌的侵染能力从而防控小麦茎基腐病。本发明利用大肠杆菌实现了在短时间内大规模合成dsRNA，克服现有技术难以大规模生产的缺点。

主权项：1.一种dsRNA用于防控小麦茎基腐病的应用，所述应用包括以下步骤：将dsRNA滴注于小麦茎基部以抑制假禾谷镰孢菌Fp487基因的表达；所述dsRNA由以下制备过程制备获得：第一步、以假禾谷镰孢菌CF14047菌株的总DNA为模板，或者以SEQIDNO.1所示假禾谷镰孢菌Fp487基因为模板；以SEQIDNO.3所示的基因片段作为制备dsRNA的靶标基因，采用SEQIDNO.6所示的上游引物和SEQIDNO.7所示的下游引物，通过PCR反应获得PCR产物；其中，上游引物序列中含有NotⅠ酶切位点，下游引物序列中含有HindⅢ酶切位点；第二步、采用限制性内切酶NotⅠ和HindⅢ对L4440载体进行双酶切，获得线性化L4440载体；所述L4440载体的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；第三步、将第一步所得PCR产物与第二步所得线性化L4440载体以同源重组酶连接，获得重组连接产物；将重组连接产物转入工程菌感受态细胞中，经培养、检测后，继续培养含有正确重组质粒的细胞，然后从中提取出重组质粒；将重组质粒转化到表达型菌株中，经培养、验证后，将正确菌种予以保存；其中，所述工程菌感受态细胞为E.coliDH5α，所述表达型菌株为E.coliHT115；第四步、将第三步所得菌种进行培养和诱导表达；之后，先从所得菌体中提取总RNA，再从总RNA中提取并纯化获得dsRNA；其中，所述诱导表达采用的诱导物为IPTG，采用Trizol法提取总RNA；从总RNA中提取并纯化获得dsRNA的过程包括：向总RNA中加入RNaseA并反应，加入DNaesⅠ并反应，加入由苯酚、氯仿、异戊醇混合而成的混合溶液，振荡后离心取上清，加入NaAC及核酸沉降剂，混合均匀，加入无水乙醇，混匀后离心弃上清，以预冷的70±2％乙醇洗涤后，离心收集沉淀，干燥后以无核酸酶水溶解，即得dsRNA。

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百度查询： 江苏省农业科学院 用于防控小麦茎基腐病的基因片段及其应用