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申请/专利权人：益普生生物制药有限公司

摘要：本发明涉及适于产生针对VAMPC‑末端神经毒素切割产物的抗体的VAMP表位，它们用于产生针对切割的VAMP的抗体的用途以及基于信号增益这些抗体在细胞VAMP切割测定中的用途。

主权项：1.一种抗原多肽，其氨基酸序列如AcNH-KLSELDDRADALQ-CONH2、SEQIDNO:15或SEQIDNO:49所示。

全文数据：细胞VAMP切割测定发明领域本发明涉及用于VAMP切割梭菌神经毒素的基于细胞的测定。背景梭菌属中的细菌产生高效且特异性的蛋白质毒素，这些毒素可以毒害它们所传递到的神经元和其他细胞。此类梭菌毒素的实例包括由破伤风梭菌C.tetani，破伤风神经毒素和肉毒杆菌C.botulinum，肉毒杆菌神经毒素血清型A至G产生的神经毒素，以及由巴氏梭菌C.baratii和丁酸梭菌C.butyricum产生的神经毒素。梭菌神经毒素通过抑制周围神经系统中，特别是在神经肌肉接头处的胆碱能传递起作用。在自然界中，梭菌神经毒素被合成为单链多肽，其通过蛋白水解切割事件在翻译后修饰以形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特定的切割位点，通常被称为活化位点，其位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。正是这种双链形式是毒素的活性形式。这两条链被称为重链H链具有约100kDa的分子量和轻链L链具有约50kDa的分子量。H链包含N末端易位组分HN结构域和C末端靶向组分HC结构域。切割位点位于L链和HN结构域之间。在HC结构域与其靶神经元结合并通过内体将结合的毒素内化到细胞中之后，HN结构域将L链转移穿过内体膜并进入胞质溶胶，并且L链提供蛋白酶功能也称为非细胞毒性蛋白酶。非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割被称为SNARE蛋白例如SNAP25，VAMP或syntaxin的细胞内转运蛋白起作用-参见GeraldK2002“CellandMolecularBiology”第4版JohnWiley&Sons，Inc。缩写SNARE来自术语可溶性NSF附着受体，其中NSF表示N-乙基马来酰亚胺敏感因子。首字母缩写SNAP25来自术语25千道尔顿的突触体相关蛋白。首字母缩写VAMP来自术语囊泡相关膜蛋白。SNARE蛋白是细胞内囊泡融合组成部分，从而是通过囊泡运输而从细胞分泌分子的组成部分。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性，对SNARE蛋白显示出高底物特异性。因此，一旦递送到所需的靶细胞，非-细胞毒性蛋白酶能够抑制细胞从靶细胞分泌。梭菌神经毒素的L链蛋白酶是切割SNARE蛋白的非细胞毒性的蛋白酶。BoNTB，BoNTD，BoNTF，BoNTG，BoNTX和TeNT的L链蛋白酶切割VAMP也称为synaptobrevins，BoNTA和BoNTE的L链蛋白酶切割SNAP25并且BoNTC的L链蛋白酶切割SNAP25和突触融合蛋白，这导致神经递质释放的抑制和随后的神经麻痹Rossetto，O.等人，“Botulinumneurotoxins：genetic，structuralandmechanisticinsight”.NatureReviewsMicrobiology12.82014：535-549Zhang等人，“Identificationandcharacterizationofanovelbotulinumneurotoxin”；NatureCommunications，2017,8：14130。梭菌神经毒素通过其受体结合结构域HC与其特异性受体结合而靶向并进入神经元，这些结构域在文献中有明确定义Schiavo，G.，Matteoli，M.&Montecucco，C.Neurotoxinsaffectedneuroxocytosis，PhysiolRev，2000,80,717-766。受体结合决定了BoNT识别神经元的功效和特异性。BoNTB，D-C和G共有两个同源突触小泡蛋白突触结合蛋白I和IISytIII作为它们的受体，而BoNTA，E，D，F和TeNT使用另一个突触小泡蛋白SV2。除蛋白质受体外，所有BoNT都需要脂质共受体神经节苷脂，其在神经元表面上是丰富的。梭菌神经毒素用于治疗运动和自主神经紊乱的疗法。一些BoNTA产品包括和和一种BoNTB产品已获得监管机构批准用于人类。传统上，BoNT药物产品的效力已经以MLD50小鼠致死剂量50单位量化，一个单位对应于小鼠中的半数致死腹膜内剂量。然而，用于肉毒杆菌毒素的MLD50单位不是标准化单位。实际上，市售毒素的不同制造商使用的测定法在稀释缓冲液的选择方面特别不同Straughan，DW，2006，ATLA343，305-313；Hambleton和Pickett，Hambleton，P.和AMPickett.，1994,JournaloftheRoyalSocietyofMedicine87.11：719。此外，由于伦理问题和最近的法规，现在优选避免使用基于动物的效力测定。基于细胞的效力测定避免了对动物测试和相关伦理问题的要求。在细胞中毒后，梭菌神经毒素的效力可以通过评估靶细胞内SNARE切割的程度来测量，例如通过Western印迹。或者，可以使用夹心ELISA方法检测和定量SNARE切割。这些方法适用于SNAP25和突触融合蛋白切割参见例如Pellett，Sabine等人，"ComparisonoftheprimaryratspinalcordcellRSCassayandthemousebioassayforbotulinumneurotoxintypeApotencydetermination."Journalofpharmacologicalandtoxicologicalmethods61.32010:304-310；Fernández-Salas,Ester等人，"BotulinumneurotoxinserotypeAspecificcell-basedpotencyassaytoreplacethemousebioassay."PLoSOne7.112012:e49516；KalandakanondS等人，CleavageofintracellularsubstratesofbotulinumtoxinsA,CandDinmammaliantargettissue”TheJournalofPharmacologyandExperimentalTherapeutics2001:749-755；PengL等人，“Cytotoxicityofbotulinumneurotoxinsrevealsadirectroleofsyntaxin1andSNAP25inneuronsurvival.”NatureCommunications2013:4:1472。然而，迄今为止，已证明来自细胞裂解物的VAMP切割产物极难检测。实际上，尽管可获得识别切割的VAMP的VAMP切割特异性抗体，并且其适于检测细胞外或细胞级分测定中的VAMP切割Hallis,Bassam,B.A.James,andCliffordC.Shone."DevelopmentofnovelassaysforbotulinumtypeAandBneurotoxinsbasedontheirendopeptidaseactivities."Journalofclinicalmicrobiology34.81996:1934-1938；Kegel,B.等人，"Aninvitroassayfordetectionoftetanusneurotoxinactivity:Usingantibodiesforrecognizingtheproteolyticallygeneratedcleavageproduct."ToxicologyinVitro21.82007:1641-1649；Fujita-Yoshigaki,Junko等人，"Vesicle-associatedMembraneProtein2IsEssentialforcAMP-regulatedExocytosisinRatParotidAcinarCellsTheInhibitionofcAMP-dependentAmylaseReleasebyBotulinumNeurotoxinB."JournalofBiologicalChemistry271.221996:13130-13134，这些抗体在细胞研究中未检测到切割的VAMP。迄今为止该领域的普遍共识是切割的VAMP产物必须在细胞中非常快地降解，因此不会促进BoNT作用的持续时间Foran，PatrickG.，等人，"EvaluationoftheTherapeuticUsefulnessofBotulinumNeurotoxinB,C1,E,andFComparedwiththeLongLastingTypeABasisforDistinctDurationsofInhibitionofExocytosisinCentralNeurons."Journalofbiologicalchemistry278.22003:1363-1371。然而，Schiavo等人已经表明，当使用考马斯蓝染色用BoNTB和TeNT处理时，从大鼠大脑皮层制备的小突触小泡级分中存在两种VAMP切割产物SchiavoG.，等人1992，TetanusandBotulinum-Bneurotoxinsblockneurotransmitterreleasebyproteolyticcleavageofsynaptobrevin.Nature359p832-835。这表明可以存在来自细胞来源的VAMP产物，尽管突触体制剂可能不包含存在于总细胞裂解物中的所有蛋白酶。Dong等人2004描述了在表达YFP-SybFL-CFP的PC12细胞中，来自两种VAMP产物的信号在被BoNTB切割后可检测到，并且YFP-N末端切割的VAMP产物分散到胞质溶胶中并且将其自身重新分配到细胞核，而CFP-C-末端产物保持定位于囊泡DongM.，等人2004Usingfluorescentsensorstodetectbotulinumneurotoxinactivityinvitroandinlivingcells.PNAS10141p14701-14706。该证据表明可能存在两种VAMP产物，但尚未知的细胞过程妨碍了对N端产物的抗体的识别。因此，标准实践是仅通过全长条带的消失来测量VAMP切割参见例如Pellett，Sabine等人，"Aneuronalcell-basedbotulinumneurotoxinassayforhighlysensitiveandspecificdetectionofneutralizingserumantibodies."FEBSletters581.252007:4803-4808.；Whitemarsh,ReginaCM,等人，"NovelapplicationofhumanneuronsderivedfrominducedpluripotentstemcellsforhighlysensitivebotulinumneurotoxindetectionBiologicalSciences:AppliedBiologicalSciences."ToxicologicalSciences,2012,1262:426–435。然而，基于信号丢失的测定法传达了错误的风险，因为总蛋白质负载可能存在差异，这将导致VAMP消失的高估或低估。在BoNT处理期间未改变的管家蛋白质可用于将VAMP消失对对照蛋白质的密度归一化。这里的缺点是抗体之间的信号需要匹配并且在线性标度中以便检测归一化目的的任何差异。虽然定性地讲这可能是BoNT活性的合理表明，但它不适用于更详细的定量，特别是用于确定药物BoNT制剂的效力。因此需要基于信号读数的增益的细胞VAMP切割测定。发明概述在第一方面，本发明提供了包含VAMP表位的抗原多肽，其中所述抗原多肽由10至65个氨基酸残基组成，其中所述VAMP表位包含一氨基酸序列，其与包含直接位于所述VAMP中的梭菌神经毒素切割位点的C-末端的至少8个氨基酸残基的VAMP序列有至少90％同一性。另一方面，本发明涉及包含本发明的抗原多肽的多肽，其中所述多肽不包含具有与天然存在的VAMP氨基酸序列具有100％序列同一性的大于17，优选16，更优选15个连续氨基酸的区域。另一方面，本发明提供了一种抗原蛋白，其包含与载体共价连接的根据本发明的多肽。另一方面，本发明提供了根据本发明的抗原多肽或蛋白质用于产生针对C-末端VAMP切割产物的抗体的用途。在一个实施方案中，本发明的表位用于产生针对C-末端VAMP切割产物的多克隆抗体。在另一个实施方案中，本发明的表位用于产生针对C-末端VAMP切割产物的单克隆抗体。另一方面，本发明提供了结合本发明的抗原多肽或蛋白质的抗体。另一方面，本发明提供了根据本发明的抗体在通过VAMP切割梭菌神经毒素增进VAMP切割的信号细胞测定中的用途。另一方面，本发明提供了一种在细胞中通过切割VAMP的梭菌神经毒素来确定VAMP切割的方法，包括：a在适合梭菌神经毒素活性的条件下，使细胞与梭菌神经毒素接触；b在通过切割VAMP的梭菌神经毒素切割VAMP后，使所述细胞的细胞质内容物与针对C末端VAMP切割产物的第一检测抗体在适于所述第一检测抗体与C末端VAMP切割产物结合的条件下接触，其中所述第一检测抗体是根据本发明的抗体；和c通过适合的方法检测所述第一检测抗体与C末端VAMP切割产物的结合。另一方面，本发明提供了一种测定受试者中针对切割VAMP的梭菌神经毒素的免疫耐受性的方法，包括：a向从受试者获得的测试样品中加入切割VAMP的梭菌神经毒素；b在适合梭菌神经毒素活性的条件下，使细胞与步骤a的测试样品接触；c在通过切割VAMP的梭菌神经毒素切割VAMP后，使所述细胞的细胞质内含物与针对C末端VAMP切割产物的第一检测抗体在适于所述第一检测抗体与C末端VAMP切割产物结合的条件下接触，其中所述第一检测抗体是根据本发明的抗体；d通过适合的方法检测第一检测抗体与C末端VAMP切割产物的结合；e定量与第一检测抗体结合的C末端VAMP切割产物的量；f用阴性对照样品代替测试样品重复步骤a至e；和g比较步骤e和f中与所述第一检测抗体结合的C-末端VAMP切割产物的量，其中相对于在步骤f中与所述第一检测抗体结合的C-末端VAMP切割产物的量，在步骤e中检测到与所述第一检测抗体结合的较低量的C-末端VAMP切割产物表明存在针对切割VAMP的梭菌神经毒素的中和抗体。另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含易受切割VAMP的神经毒素中毒的细胞；和针对切割的VAMP的第一检测抗体，其中所述第一检测抗体是根据本发明的抗体。发明详述本发明基于发明人的发现，即基于信号读数的增益，可以产生适用于细胞VAMP切割测定的抗体。特别地，本发明人已经表明，为了在体外检测VAMP切割，检测位于BoNT切割位点的C末端侧的表位是关键。实际上，本发明人已经证明通过Western印迹WB使用结合位于BoNTF和或BoNTD和或BoNTB切割位点的C末端侧的表位的抗体成功检测了神经元VAMP2切割产物，所述切割位点与BoNTD和或BoNTF和或BoNTB切割位点相邻。特别是，这种抗体能够检测细胞裂解物中的全长VAMP和切割产物。该工具通过监测切割的VAMP产物的外观，能够定量评估BoNT在信号增益细胞测定中的效力。在第一方面，本发明提供了包含VAMP表位的抗原多肽，其中所述抗原多肽由10至65个氨基酸残基组成，其中所述VAMP表位包含一氨基酸序列，其与包含直接位于所述VAMP中梭菌神经毒素切割位点的C-末端的至少8个氨基酸残基的VAMP序列有至少90％同一性。本文所用的术语“梭菌神经毒素”是指进入神经元并抑制神经递质释放的任何多肽。该过程包括神经毒素与低或高亲和力受体的结合、神经毒素的内化、神经毒素的内肽酶部分易位到细胞质中以及神经毒素底物的酶促修饰。更具体地，术语“梭菌神经毒素”包括由梭菌属细菌产生的进入神经元并抑制神经递质释放的任何多肽，以及通过重组技术或化学技术产生的此类多肽。它是双链形式，是神经毒素的活性形式。这两条链被称为重链H链，其具有约100kDa的分子量，和轻链L链，其具有约50kDa的分子量。梭菌神经毒素包括肉毒杆菌神经毒素BoNT和破伤风神经毒素TeNT。BoNT血清型A至G可以基于通过特定中和抗血清的失活来区分，血清型的这种分类与氨基酸水平上的百分比序列同一性相关。基于氨基酸百分比序列同一性，将给定血清型的BoNT蛋白进一步分成不同的亚型。BoNTA神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQIDNO：1UniProt登录号A5HZZ9。BoNTB神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQIDNO：2UniProt登录号B1INP5。BoNTC神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQIDNO：3UniProt登录号P18640。BoNTD神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQIDNO：4UniProt登录号P19321。BoNTE神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQIDNO：5NCBIRefSeq登录号WP_003372387。BoNTF神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQIDNO：6UniProt登录号Q57236。BoNTG神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQIDNO：7NCBIRefSeq登录号WP_039635782。BoNTX神经毒素氨基酸序列的实例提供为SEQIDNO：41Genbank登录号BAQ12790.1。TeNT氨基酸序列的实例提供为SEQIDNO：8UniProt登录号P04958。本文所用的术语“HC结构域”是指神经毒素重链的功能不同的区域，其分子量约为50kDa，能够使神经毒素与位于靶细胞表面的受体结合。HC结构域由两个结构不同的亚结构域组成，“HCN亚结构域”HC结构域的N末端部分和“HCC亚结构域”HC结构域的C末端部分，每个亚结构域的分子量均为大约25kDa。本文所用的术语“LHN结构域”是指缺乏HC结构域并由内肽酶结构域“L”或“轻链”组成的神经毒素和负责内肽酶易位到细胞质中的结构域重链的HN结构域。示例性的L，HN，HCN和HCC结构域在表1中示出。表1-示例性L，HN，HCN和HCC结构域上述鉴定的参考序列应被视为指导，因为根据亚血清型可能发生轻微变化。举例来说，US20070166332通过引用整体并入本文引用了略微不同的梭菌序列。囊泡相关膜蛋白VAMP是SNARE蛋白家族，其具有相似的结构并参与囊泡融合和胞吐作用，特别是神经递质释放。VAMP是SNARE蛋白家族的成员，称为突触泡蛋白家族，包括成员如VAMP1，VAMP2也称为突触泡蛋白，VAMP3也称为cellubrevin，VAMP4，VAMP5，VAMP7也称为SYBL1，或破伤风不敏感的VAMP，VAMP8也称为endobrevin，YKT6，SEC22A等。VAMP1，VAMP2和VAMP3被BoNTB，BoNTD，BoNTF，BoNTG，BoNTX和TeNT的轻链切割。BoNTX还可以切割VAMP4，VAMP5和YKT6。本文所用的术语“VAMP表位”是指抗体结合的VAMP蛋白的一部分。在一个优选的实施方案中，本发明的抗原多肽由10至65，10至60，10至55，10至50，10至45，10至40，10至35，10至30，10至25，10至20，10至19，10至18，10至17，10至16或10至15个氨基酸残基，优选10至15个氨基酸残基组成。例如，本发明的抗原多肽可以由10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64或65个氨基酸残基组成。在一个优选的实施方案中，本发明的抗原多肽包含VAMP表位或由其组成，所述VAMP表位包含一氨基酸序列，其与包含直接位于所述VAMP中的梭菌神经毒素切割位点C末端的至少8，9，10，11，12，13，14，15，16或17个氨基酸残基的VAMP序列有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性。天然存在的VAMP，特别是大鼠和人VAMP1，VAMP2，VAMP3，VAMP4，VAMP5和YKT6的氨基酸序列及其相应的梭菌神经毒素VAMP切割位点示于表2和图1中。表2-梭菌神经毒素VAMP切割位点在一个实施方案中，VAMP选自VAMP1，VAMP2，VAMP3，VAMP4，VAMP5和或YKT6。在一个实施方案中，VAMP选自VAMP1，VAMP2和或VAMP3。在一个实施方案中，VAMP选自VAMP4，VAMP5和或YKT6。在优选的实施方案中，VAMP是人VAMP，更优选人VAMP1，VAMP2，VAMP3，VAMP4，VAMP5和或YKT6。在一个实施方案中，VAMP选自人VAMP1，VAMP2和或VAMP3。在一个实施方案中，VAMP选自人VAMP4，VAMP5和或YKT6。在本发明的抗原多肽的一个实施方案中，VAMP表位是BoNTF切割的VAMP表位，其中至少8个氨基酸残基直接位于VAMP中的BoNTF切割位点的C末端。BoNTFVAMP表位，更特别是BoNTFVAMP1，VAMP2和或VAMP3表位的实例，包括：·KLSELDDRADALQSEQIDNO：15·QKLSELDDRADALQSEQIDNO：16·KLSELDDRADSEQIDNO：17·KLSELDDRADALQAGASSEQIDNO：18·DQKLSELDDRADALQSEQIDNO：31。在一个实施方案中，BoNTFVAMP表位，特别是BoNTFVAMP1，VAMP2和或VAMP3表位，包含与选自SEQIDNO：15至SEQIDNO：18和SEQIDNO：31的序列有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在优选的实施方案中，BoNTFVAMP表位包含与KLSELDDRADALQSEQIDNO：15有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在更优选的实施方案中，BoNTFVAMP表位包含KLSELDDRADALQSEQIDNO：15或由其组成。在本发明的抗原多肽的一个实施方案中，VAMP表位是BoNTDVAMP表位，其中至少8个氨基酸残基直接位于VAMP中的BoNTD切割位点的C末端。BoNTDVAMP表位，更特别是BoNTDVAMP1，VAMP2和或VAMP3表位的实例，包括：·KLSELDDRADALQSEQIDNO：15·LSELDDRADALQSEQIDNO：19·LSELDDRADASEQIDNO：20·LSELDDRADALQAGASSEQIDNO：21。在一个实施方案中，BoNTDVAMP表位，特别是BoNTDVAMP1，VAMP2和或VAMP3表位，包含与选自SEQIDNO：15和SEQIDNO：19至SEQIDNO：21的序列有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在优选的实施方案中，BoNTDVAMP表位包含与KLSELDDRADALQSEQIDNO：15的氨基酸序列有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在更优选的实施方案中，BoNTDVAMP表位包含KLSELDDRADALQSEQIDNO：15或由其组成。在本发明的抗原多肽的一个实施方案中，VAMP表位是BoNTF5或BoNTFA切割的VAMP表位，其中至少8个氨基酸残基直接位于VAMP中BoNTF5或BoNTFA切割位点的C-末端。BoNTF5或BoNTFAVAMP表位，更特别是BoNTF5或BoNTFAVAMP1，VAMP2和或VAMP3表位的实例，包括：·ERDQKLSELDDRASEQIDNO：32·LERDQKLSELDDRASEQIDNO：33·VLERDQKLSELDDRASEQIDNO：34。在一个实施方案中，BoNTF5或BoNTFAVAMP表位，特别是BoNTF5或BoNTFAVAMP1，VAMP2和或VAMP3表位，包含与选自SEQIDNO：32至SEQIDNO：34的序列有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在优选的实施方案中，BoNTF5或BoNTFAVAMP表位包含与ERDQKLSELDDRASEQIDNO：32的氨基酸序列有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在更优选的实施方案中，BoNTF5或BoNTFAVAMP表位包含ERDQKLSELDDRASEQIDNO：32或由其组成。在本发明的抗原多肽的一个实施方案中，VAMP表位是BoNTB或TeNTVAMP表位，其中至少8个氨基酸残基直接位于VAMP中的BoNTB或TeNT切割位点的C末端。BoNTB或TeNTVAMP表位，更特别是BoNTB或TeNTVAMP1，VAMP2和或VAMP3表位的实例，包括：·FETSAAKLKRKYWSEQIDNO：22·FESSAAKLKRKYWSEQIDNO：23·QFETSAAKLKRKYWSEQIDNO：24·FETSAAKLKRSEQIDNO：25·FETSAAKLKRKYWWKNSEQIDNO：26·ETSAAKLKRKYWWKSEQIDNO：48·FETSAAKLKRKYWWKSEQIDNO：49·QFESSAAKLKRKYWSEQIDNO：50·FESSAAKLKRSEQIDNO：51·FESSAAKLKRKYWWKSEQIDNO：52。在一个实施方案中，BoNTB或TeNTVAMP表位，特别是BoNTB或TeNTVAMP1，VAMP2和或VAMP3表位，包含与选自SEQIDNO：22至SEQIDNO：26和SEQIDNO：48至SEQIDNO：52的序列有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一个优选的实施方案中，BoNTB或TeNTVAMP表位包含与FETSAAKLKRKYWSEQIDNO：22或FETSAAKLKRKYWWKSEQIDNO：49有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在更优选的实施方案中，BoNTB或TeNTVAMP表位包含FETSAAKLKRKYWSEQIDNO：22或FETSAAKLKRKYWWKSEQIDNO：49或由其组成。令人惊讶的是，结合后一表位的抗体不仅允许检测BoNTBVAMP切割，而且还允许检测BoNTFVAMP切割。在本发明的抗原多肽的一个实施方案中，VAMP表位是BoNTGVAMP表位，其中至少8个氨基酸残基直接位于VAMP中的BoNTG切割位点的C-末端。BoNTGVAMP表位，更特别是BoNTG，VAMP1，VAMP2和或VAMP3表位的实例，包括：·AKLKRKYWWKNSEQIDNO：27·AAKLKRKYWWKNSEQIDNO：28·AKLKRKYWWKNCKMSEQIDNO：29·AKLKRKYWWKNLKMSEQIDNO：30。在一个实施方案中，BoNTGVAMP表位，特别是BoNTGVAMP1，VAMP2和或VAMP3表位，包含与选自SEQIDNO：27至SEQIDNO：30的序列有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在优选的实施方案中，BoNTGVAMP表位包含与AKLKRKYWWKNSEQIDNO：27有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在更优选的实施方案中，BoNTGVAMP表位包含AKLKRKYWWKNSEQIDNO：27或由其组成。在本发明的抗原多肽的一个实施方案中，VAMP表位是BoNTXVAMP表位，其中至少8个氨基酸残基直接位于VAMP中的BoNTX切割位点的C-末端。BoNTXVAMP表位，更特别是BoNTXVAMP1，VAMP2和或VAMP3表位的实例，包括：·ADALQAGASQFSEQIDNO：53·ADALQAGASQSEQIDNO：54·RADALQAGASQFSEQIDNO：55·ADALQAGASQFESEQIDNO：56·ADALQAGASVFSEQIDNO：57·ADALQAGASVSEQIDNO：58·ADALQAGASVFESEQIDNO：59·RADALQAGASVFSEQIDNO：60·RADALQAGASSEQIDNO：61。在一个实施方案中，BoNTXVAMP表位，特别是BoNTXVAMP1，VAMP2和或VAMP3表位，包含与选自SEQIDNO：53至SEQIDNO：61的序列有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在优选的实施方案中，BoNTXVAMP表位包含与ADALQAGASQFSEQIDNO：53有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在更优选的实施方案中，BoNTXVAMP表位包含ADALQAGASQFSEQIDNO：53或由其组成。BoNTXVAMP表位，更特别是BoNTXVAMP4表位的其他实例，包括：·SESLSDNATAFSEQIDNO：62·SESLSDNATASEQIDNO：63·KSESLSDNATAFSEQIDNO：64·SESLSDNATAFSSEQIDNO：65。在一个实施方案中，BoNTXVAMP表位，特别是BoNTXVAMP4表位，包含与选自SEQIDNO：62至SEQIDNO：65的序列有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在优选的实施方案中，BoNTXVAMP表位包含与SESLSDNATAFSEQIDNO：62有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在更优选的实施方案中，BoNTXVAMP表位包含SESLSDNATAFSEQIDNO：62或由其组成。BoNTXVAMP表位，更特别是BoNTXVAMP5表位的其他实例，包括：·SDQLLDMSSTFSEQIDNO：66·SDQLLDMSSTSEQIDNO：67·RSDQLLDMSSTFSEQIDNO：68·SDQLLDMSSTFNSEQIDNO：69·SDQLLDMSSAFSEQIDNO：70·SDQLLDMSSASEQIDNO：71·RSDQLLDMSSAFSEQIDNO：72·SDQLLDMSSAFSSEQIDNO：73·RSDQLLDMSSSEQIDNO：74。在一个实施方案中，BoNTXVAMP表位，特别是BoNTXVAMP5表位，包含与选自SEQIDNO：66至SEQIDNO：74的序列有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在优选的实施方案中，BoNTXVAMP表位包含与SDQLLDMSSTFSEQIDNO：66有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在更优选的实施方案中，BoNTXVAMP表位包含SDQLLDMSSTFSEQIDNO：66或由其组成。BoNTXVAMP表位，更特别是BoNTXYKT6表位的其他实例，包括：·SEVLGTQSKAFSEQIDNO：75·SEVLGTQSKASEQIDNO：76·KSEVLGTQSKAFSEQIDNO：77·SEVLGTQSKAFYSEQIDNO：78。在一个实施方案中，BoNTXVAMP表位，特别是BoNTXYKT6表位，包含与选自SEQIDNO：75至SEQIDNO：78的序列有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在优选的实施方案中，BoNTXVAMP表位包含与SEVLGTQSKAFSEQIDNO：75有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。在更优选的实施方案中，BoNTXVAMP表位包含SEVLGTQSKAFSEQIDNO：75或由其组成。本文中，两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“序列同一性百分比”是在由比对序列共有的相同位置处的相同核苷酸或氨基酸的数量的函数。因此，％同一性可以计算为比对中每个位置的相同核苷酸或氨基酸的数量除以比对序列中的核苷酸或氨基酸的总数，乘以100。％序列同一性的计算也可以考虑空位的数量，以及为优化两个或更多个序列的比对需要被引入的每个空位的长度。两个或多个序列之间的序列比较和百分比同一性的确定可以使用本领域技术人员熟悉的特定数学算法来进行，例如全局比对数学算法例如由Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.483，443-453,1972描述的。另一方面，本发明涉及包含根据本发明的抗原多肽的多肽，其中所述多肽不包含与天然存在的VAMP氨基酸序列具有100％序列同一性的大于17，16，15，14，13，12，11，10，优选16，更优选15个连续氨基酸。本领域技术人员容易理解，这种多肽也是抗原性的。在优选的实施方案中，多肽包含共价接头，优选在其N-末端和或在C-末端。以下提供根据本发明合适的共价接头的实例。另一方面，本发明提供了一种抗原蛋白，其包含与载体共价连接的本发明多肽。优选地，载体是非免疫原性或弱免疫原性蛋白质。合适的载体的实例包括匙孔血蓝蛋白KLH，卵清蛋白OVA，甲状腺球蛋白THY，牛血清白蛋白BSA，大豆胰蛋白酶抑制剂STI或多附着肽MAP。在一个实施方案中，抗原蛋白包含本发明多肽其可能已经包含如上所述的接头和载体之间的共价接头。所述接头可以是一种或多种天然或非天然的氨基酸，如本领域所熟知的，由于在它们的N-末端、C-末端和或侧链存在活性基团，所述氨基酸可与多肽和或载体的其他氨基酸形成共价键。值得注意的是，在N-末端和或侧链中具有伯胺基团-NH2的氨基酸例如赖氨酸可以与在C-末端和或侧链具有羧基-COOH的氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸反应形成共价键；侧链具有巯基-SH的氨基酸如半胱氨酸或硒代半胱氨酸可与侧链具有巯基-SH的氨基酸如半胱氨酸或硒代半胱氨酸反应形成共价键。例如，共价接头可以是在本发明多肽的C-末端或N-末端添加的半胱氨酸，所述半胱氨酸与在载体中添加或存在的另一个半胱氨酸形成二硫桥。或者或另外，共价接头可以是形成间隔物的几个氨基酸的形式，例如接头可以是包含具有小侧链R基团的非带电氨基酸例如甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸或丝氨酸的肽。本发明的合适间隔物的实例包括G-间隔物，例如GGG，GGGG和GGGGS，或A-间隔物，例如AAA，AAAA和AAAAV。在一个实施方案中，接头由约1至约30个氨基酸残基组成，优选约2至约25个氨基酸残基，更优选约3至约20个氨基酸残基，例如，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个氨基酸残基。另一方面，本发明提供了根据本发明的抗原多肽或蛋白质用于产生针对C-末端VAMP切割产物的抗体的用途。在一个实施方案中，本发明的表位用于产生针对C-末端VAMP切割产物的多克隆抗体。在另一个实施方案中，本发明的表位用于产生针对C-末端VAMP切割产物的单克隆抗体。产生抗体的方法是本领域熟知的，参见例如Greenfield，EdwardA.，编，Antibodies:alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,2014；Leenaars,Marlies,和CoenraadFMHendriksen."Criticalstepsintheproductionofpolyclonalandmonoclonalantibodies:evaluationandrecommendations."IlarJournal46.32005:269-279。结合如本文所述VAMP表位的多克隆抗体可以通过用本发明的抗原多肽或蛋白质注射动物，例如，哺乳动物，如兔子，山羊，小鼠，仓鼠或猴子，或卵，如鸡蛋来产生。本文公开的VAMP表位的多克隆抗体可以从动物例如从血液或卵中分离，并通过众所周知的技术进一步纯化，例如蛋白质亲和层析以获得IgG级分，或通过针对用于产生抗体的VAMP表位的亲和纯化。一些合同研究组织提供定制的抗体生成服务，例如Eurogentec公司提供“快速28天计划”，他们在第0天进行免疫，然后在第7天，第10天和第18天进行3次加强免疫注射，第21天中间取血和第28天最后取血。这是本领域众所周知的多克隆抗体生产的一般技术的一个实例。可以使用杂交瘤方法产生结合如本文所述的VAMP表位的单克隆抗体。参见，例如，第7章，Greenfield,EdwardA.,编，Antibodies:alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,2014。简言之，将宿主动物，例如哺乳动物如兔，山羊，小鼠，仓鼠或猴子暴露于一次或多次注射本发明的抗原多肽或蛋白质以引发产生或能够产生特异性结合切割的VAMP的抗体的淋巴细胞。可以通过标准技术随时间监测免疫动物中的抗体滴度，例如用ELISA酶联免疫吸附测定法。或者，可以使用合适的细胞培养系在体外免疫淋巴细胞。在免疫后的适当时间，例如当抗体滴度最高时，从动物中分离产生抗体的细胞。通常，如果需要人源细胞，则使用外周血淋巴细胞，或者如果需要非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。使用合适的融合剂例如聚乙二醇将分离的抗体生成细胞与永生细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。永生细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物，牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，将鼠骨髓瘤细胞系与从适当免疫的小鼠收获的脾细胞融合以产生杂交瘤。优选的永生细胞系是对含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷HAT的培养基敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。根据标准技术，许多骨髓瘤细胞系中的任何一种都可以用作融合伴侣，例如P3-NS11-Ag4-1，P3-x63-Ag8.653或Sp2O-Ag14骨髓瘤系。然后使用HAT培养基选择由融合产生的杂交瘤细胞，其杀死未融合和非生产性融合的骨髓瘤细胞未融合的脾细胞在培养几天后死亡，因为它们未被转化。然后可以测定其中生长杂交瘤细胞的培养基中是否存在结合如本文所述的VAMP表位的单克隆抗体。例如，可以在免疫沉淀测定中使用切割的VAMP阳性培养基，体外结合测定法，例如放射免疫测定法RIA或酶联免疫吸附测定法ELISA，或在基于细胞的活性测定中筛选杂交瘤上清液。单克隆抗体的结合亲和力也可以通过例如Scatchard分析来确定。参见，例如，PeterJ.Munson和DavidRodbard,Ligand：AVersatileComputerizedApproachForCharacterizationofLigand-BindingSystems，1071Anal.Biochem.220-2391980。在鉴定出所需的杂交瘤细胞后，使用有限稀释程序分离源自单个细胞的克隆，直至获得表达所需单克隆抗体的克隆细胞系。或者，可以通过用本发明的抗原多肽、蛋白质或肽筛选重组组合免疫球蛋白文库，例如抗体噬菌体展示文库，来产生结合如本文所述的VAMP表位的单克隆抗体。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是可商购的，例如重组噬菌体抗体系统AmershamGEHealthcare，Piscataway，NJ；和噬菌体展示试剂盒Stratagene，LaJoIIa，CA。另外，用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可以在例如Ladner等人美国专利5,223,409；Borrebaeck等人美国专利5,712,089；Griffiths等人美国专利5,885,793；Griffiths等人美国专利5,962,255；McCafferty等人美国专利5,969,108；Griffiths等人美国专利6,010,884；Jespers等人美国专利6,017,732；Borrebaeck等人美国专利6,027,930；Johnson等人美国专利6,140,471；McCafferty等人美国专利6,172,197中找到，其每个都通过引用整体并入本文。另一方面，本发明提供了结合本发明的抗原多肽或蛋白质的抗体。在一个实施方案中，抗体是多克隆抗体。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。抗体与抗原多肽或蛋白质之间的结合亲和力可以通过测定平衡解离常数KD来评估，该平衡解离常数测量新抗体-抗原复合物形成的速率等于抗体-抗原复合物在平衡时解离的速率。平衡解离常数以M表示，并且由平衡时的KdKa比定义，其中Ka是抗体的结合速率常数，Kd是抗体的解离速率常数。KD＝[Ab]x[Ag][Ab+Ag]，其中[Ab]是抗体的摩尔浓度，[Ag]是抗原的摩尔浓度，并且[Ab+Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，其中当系统处于平衡时，所有浓度是这些组分的浓度。平衡解离常数越小，抗体与其抗原的结合越紧密，或抗体与抗原之间的结合亲和力越高。在一个实施方案中，本发明的抗体与抗原多肽或蛋白质表位之间的KD低于10-6M。在优选的实施方案中，本发明的抗体与抗原多肽或蛋白质之间的KD低于10-7M。在更优选的实施方案中，本发明的抗体与抗原多肽或蛋白质之间的KD低于10-8M。在更优选的实施方案中，本发明的抗体与抗原多肽或蛋白质之间的KD低于10-9M。在更优选的实施方案中，本发明的抗体与抗原多肽或蛋白质之间的KD低于10-10M。在更优选的实施方案中，本发明的抗体与抗原多肽或蛋白质之间的KD低于10-11M。在更优选的实施方案中，本发明的抗体与抗原多肽或蛋白质之间的KD低于10-12M。另一方面，本发明提供了根据本发明的抗体在通过VAMP切割梭菌神经毒素进行VAMP切割的信号增益细胞测定中的用途。在一个实施方案中，该用途是体外或离体使用。另一方面，本发明提供了一种在细胞中通过切割VAMP的梭菌神经毒素来确定VAMP切割的方法，包括：a在适合梭菌神经毒素活性的条件下，使细胞与梭菌神经毒素接触；b在通过切割VAMP的梭菌神经毒素切割VAMP后，使所述细胞的细胞质内容物与针对C末端VAMP切割产物的第一检测抗体在适于第一检测抗体与C末端VAMP切割产物结合的条件下接触，其中所述第一检测抗体是根据本发明的抗体；和c通过适合的方法检测所述第一检测抗体与C末端VAMP切割产物的结合。在一个实施方案中，根据本发明的方法还包括d通过适合的方法定量与所述第一检测抗体结合的C末端VAMP切割产物的量。在本发明方法的一个实施方案中，步骤b包括在适于所述第二检测抗体与全长VAMP结合的条件下，使所述细胞的细胞质内容物与针对全长VAMP的第二检测抗体接触；步骤c包括通过适合的方法检测第二检测抗体与全长VAMP的结合，步骤d包括通过适合的方法定量与所述第二检测抗体结合的全长VAMP的量。在一个实施方案中，该方法是体外或离体方法。本领域技术人员清楚的是，与第一抗体结合的C末端VAMP切割产物的量的增加和或与第二检测抗体结合的全长VAMP的量的减少表明切割VAMP的梭菌神经毒素导致的VAMP切割增加。在一个实施方案中，第二检测抗体与第一检测抗体相同，并结合C末端VAMP切割产物和全长VAMP。在一个备选实施方案中，第二检测抗体不同于所述第一检测抗体，并且与全长VAMP结合但不与C-末端VAMP切割产物结合。合适地，第二检测抗体与梭菌神经毒素切割位点N末端的VAMP表位结合。合适的抗体的实例包括市售抗体，例如ab3347Abcam或ab181869Abcam。在一个具体实施方案中，通过确定在细胞中切割VAMP的梭菌神经毒素的VAMP切割的方法，包括：a在适合梭菌神经毒素活性的条件下，使细胞与梭菌神经毒素接触；b使所述细胞的细胞质内容物进行：·在通过切割VAMP的梭菌神经毒素切割VAMP后，在适于第一检测抗体与C末端VAMP切割产物结合的条件下，接触针对C末端VAMP切割产物的第一检测抗体，其中所述第一检测抗体是根据本发明的抗体，其与C末端VAMP切割产物和全长VAMP结合；和·接触第二检测抗体，其与全长VAMP结合但不与C末端VAMP切割产物结合；c通过适合的方法检测·第一抗体与C末端VAMP切割产物和全长VAMP的结合；和·第二检测抗体与全长VAMP的结合；和d通过适当的方式量化：·C末端VAMP切割产物和与第一检测抗体结合的全长VAMP的组合量；和·与第二检测抗体结合的全长VAMP的量。本领域技术人员清楚的是，与第二检测抗体结合的全长VAMP的量减少，以及与第一检测抗体结合的全长和C末端VAMP切割产物的组合量没有变化表明切割VAMP的梭菌神经毒素的VAMP切割。在另一个具体的实施方案中，确定在细胞中通过切割VAMP的梭菌神经毒素的VAMP切割的方法包括：a在适合梭菌神经毒素活性的条件下，使细胞与梭菌神经毒素接触；b通过切割VAMP的梭菌神经毒素切割VAMP后，使所述细胞的细胞质内容物与针对C末端VAMP切割产物的第一检测抗体在适于第一检测抗体与C末端VAMP结合的条件下接触，其中所述第一检测抗体是根据本发明的抗体，其结合C末端VAMP切割产物和全长VAMP；c通过适合的方法检测·第一抗体与C末端VAMP切割产物的结合；和·第一检测抗体与全长VAMP的结合；其中，第一检测抗体与C末端VAMP切割产物结合产生的信号可以与第一检测抗体与全长VAMP结合产生的信号区分开；和d通过适当的方式量化：·与第一检测抗体结合的C末端VAMP切割产物的量；和·与第一检测抗体结合的全长VAMP的量。本领域技术人员清楚的是，与第一抗体结合的C末端VAMP切割产物的量的增加和与第一检测抗体结合的全长VAMP的量的减少表明通过切割VAMP的梭菌神经毒素的VAMP切割增加。另一方面，本发明提供了一种测定受试者中对切割VAMP的梭菌神经毒素的免疫耐受性的方法，包括：a向从受试者获得的测试样品中加入切割VAMP的梭菌神经毒素；b在适合梭菌神经毒素活性的条件下，使细胞与步骤a的测试样品接触；c通过切割VAMP的梭菌神经毒素切割VAMP后，使所述细胞的细胞质内容物与针对C末端VAMP切割产物的第一检测抗体在适于第一检测抗体与C末端VAMP切割产物结合的条件下接触，其中所述第一检测抗体是根据本发明的抗体；d通过适合的方法检测第一检测抗体与C末端VAMP切割产物的结合；e量化与第一检测抗体结合的C末端VAMP切割产物的量；f用阴性对照样品代替测试样品重复步骤a至e；和g比较步骤e和f中与所述第一检测抗体结合的C-末端VAMP切割产物的量，其中相对于在步骤f中与所述第一检测抗体结合的C-末端VAMP切割产物的量，在步骤e中检测到与所述第一检测抗体结合的较低量的C-末端VAMP切割产物，表明存在针对切割VAMP的梭菌神经毒素的中和抗体。在一个实施方案中，步骤f还包括用阳性对照样品重复步骤a至e。如本文所用，术语“针对切割VAMP的梭菌神经毒素的中和抗体”是指在生理条件下将以减少或防止切割VAMP的梭菌神经毒素在受试者中发挥其治疗作用的方式结合切割VAMP的梭菌神经毒素的任何抗体。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在优选的实施方案中，受试者是人。在一个实施方案中，样品选自从受试者获得的血液、血浆、血清和淋巴液。在暴露于切割VAMP的梭菌神经毒素之前，在用切割VAMP的梭菌神经毒素的单次处理之后或在用切割VAMP的梭菌神经毒素的多次处理之后，可以从受试者获得测试样品。在一个具体实施方案中，测试样品来自对用切割VAMP的梭菌神经毒素处理具有抗性的受试者。如本文所用，术语“对照样品”是指其中已知存在或不存在测试样品的任何样品，并且包括阴性和阳性对照样品。关于针对切割VAMP的梭菌神经毒素的中和抗体，可以从未暴露于切割VAMP的梭菌神经毒素的个体获得阴性对照样品，并且可以包括但不限于来自提供测试样品但在接受切割VAMP的梭菌神经毒素治疗前获取的相同个体的样品；取自从未暴露于切割VAMP的梭菌神经毒素的不同个体的样品；从多个从未暴露于切割VAMP的梭菌神经毒素的不同个体中获取的合并样品。关于针对切割VAMP的梭菌神经毒素的中和抗体，可以从对切割VAMP的梭菌神经毒素表现出免疫抗性的个体获得阳性对照样品，并且包括但不限于在基于患者的测试测定中的测试阳性的个体；在体内生物测定中的测试阳性的个体；以及显示超免疫的个体，例如接种针对切割VAMP的梭菌神经毒素的受试者。在一个实施方案中，该方法是体外或离体方法。在用于确定免疫抗性的方法的一个实施方案中，步骤c包括在适于所述第二检测抗体与全长VAMP结合的条件下，使所述细胞的细胞质内容物与针对全长VAMP的第二检测抗体接触；步骤d包括通过适合的方法检测第二检测抗体与全长VAMP的结合，步骤e包括定量与所述第二检测抗体结合的全长VAMP的量。在一个实施方案中，第二检测抗体与第一检测抗体相同，并结合C末端VAMP切割产物和全长VAMP。在一个备选实施方案中，第二检测抗体不同于所述第一检测抗体，并且与全长VAMP结合但不与C-末端VAMP切割产物结合。合适地，第二检测抗体与梭菌神经毒素切割位点N末端的VAMP表位结合。合适的抗体的实例包括市售抗体，例如ab3347Abcam或ab181869Abcam。在一个具体实施方案中，确定受试者中切割VAMP的梭菌神经毒素的免疫耐受性的方法包括：a向从受试者获得的测试样品中加入切割VAMP的梭菌神经毒素；b在适合梭菌神经毒素活性的条件下，使细胞与步骤a的测试样品接触；c使所述细胞的细胞质内容物进行·通过切割VAMP的梭菌神经毒素的VAMP切割后，在适于第一检测抗体与C末端VAMP切割产物结合的条件下，接触针对C末端VAMP切割产物的第一检测抗体，其中所述第一检测抗体是根据本发明的抗体，其与C末端VAMP切割产物和全长VAMP结合；和·接触第二检测抗体，其与全长VAMP结合但不与C末端VAMP切割产物结合；d通过适合的方法检测·第一抗体与C末端VAMP切割产物和全长VAMP的结合；和·第二检测抗体与全长VAMP的结合；e量化·C末端VAMP切割产物和与第一检测抗体结合的全长VAMP的组合量；和·与第二检测抗体结合的全长VAMP的量；f用阴性对照样品代替测试样品重复步骤a至e；和g比较步骤e和f中与所述第一检测抗体结合的C-末端VAMP切割产物的量，其中相对于在步骤f中的相应量，在步骤e中检测到与所述第一检测抗体结合的C-末端VAMP切割产物和全长VAMP的较低量和或与第二检测抗体结合的全长VAMP的较高量表明存在针对切割VAMP的梭菌神经毒素的中和抗体。在另一个具体实施方案中，确定受试者中对切割VAMP的梭菌神经毒素的免疫耐受性的方法包括：a向从受试者获得的测试样品中加入切割VAMP的梭菌神经毒素；b在适合梭菌神经毒素活性的条件下，使细胞与步骤a的测试样品接触；c通过切割VAMP的梭菌神经毒素的VAMP切割后，在适于第一检测抗体与C末端VAMP切割产物结合的条件下，所述细胞的细胞质内容物接触针对C末端VAMP切割产物的第一检测抗体，其中所述第一检测抗体是根据本发明的抗体，其结合C末端VAMP切割产物和全长VAMP；d通过适合的手段检测·第一抗体与C末端VAMP切割产物和全长VAMP的结合；和·第一检测抗体与全长VAMP的结合；其中第一检测抗体与C末端VAMP切割产物结合产生的信号可以与第一检测抗体与全长VAMP结合产生的信号区分开；e量化·与第一检测抗体结合的C末端VAMP切割产物的量；和·与第一检测抗体结合的全长VAMP的量；f用阴性对照样品代替试样重复步骤a到e；g比较步骤e和f中与所述第一检测抗体结合的C-末端VAMP切割产物的量，其中相对于在步骤f中的相应量,在步骤e中与所述第一检测抗体结合的C-末端VAMP切割产物的较低量和或与第一检测抗体结合的全长VAMP的较高量表明存在针对切割VAMP的梭菌神经毒素的中和抗体。本文中，“切割VAMP的梭菌神经毒素”是指梭菌神经毒素，其与靶细胞上的受体结合，将梭菌轻链L转移到胞质溶胶中，然后蛋白水解切割VAMP，从而通过由细胞囊泡运输破坏分子的分泌。优选地，在本发明的方法或用途中，切割VAMP的梭菌神经毒素包括BoNTB，BoNTD，BoNTF，BoNTG，BoNTX或TeNT轻链。合适地，BoNTB，BoNTD，BoNTF，BoNTG，BoNTX或TeNT轻链包含选自以下的序列：-SEQIDNO：2的氨基酸残基1至441，或与其具有至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的多肽序列，-SEQIDNO：4的氨基酸残基1至442，或与其具有至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的多肽序列，-SEQIDNO：6的氨基酸残基1至439，或与其具有至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的多肽序列，-SEQIDNO：7的氨基酸残基1至446，或与其具有至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的多肽序列，-SEQIDNO：41的氨基酸残基1至439，或与其具有至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的多肽序列，和-SEQIDNO：8的氨基酸残基1至456，或与其具有至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的多肽序列。应理解，如本文所述的BoNTB，BoNTD，BoNTF，BoNTG，BoNTX或TeNT轻链具有切割VAMP的能力。在本发明方法或用途的一个实施方案中，切割VAMP的梭菌神经毒素选自BoNTB，BoNTD，BoNTF，BoNTG，BoNTX和TeNT。适当地，BoNTB，BoNTD，BoNTF，BoNTG，BoNTX或TeNT包含选自以下的序列：-SEQIDNO：2或与其具有至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的多肽序列，-SEQIDNO：4，或与其具有至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的多肽序列，-SEQIDNO：6，或与其具有至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的多肽序列，-SEQIDNO：7，或与其具有至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的多肽序列，-SEQIDNO：41，或与其具有至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的多肽序列，和-SEQIDNO：8，或与其具有至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的多肽序列。应理解，如本文所述的BoNTB，BoNTD，BoNTF，BoNTG，BoNTX或TeNT梭菌神经毒素具有结合靶细胞上的受体，将梭菌轻链转移到细胞质和切割VAMP的能力。在一个实施方案中，切割VAMP的梭菌神经毒素是镶嵌mosaic神经毒素。在本文中使用的术语“镶嵌神经毒素”是指天然存在的梭菌神经毒素，其包含来自另一种梭菌神经毒素例如不同血清型的梭菌神经毒素的至少一个功能结构域，所述梭菌神经毒素通常不包含至少一个功能结构域。天然存在的切割VAMP的镶嵌神经毒素的实例是BoNTDC和BoNTFA。BoNTDC包含血清型D的L链和HN结构域和血清型C的HC结构域，NakamuraK等人，“CharacterizationoftheDCmosaicneurotoxinproducedbyClostridiumbotulinumassociatedwithbovinebotulisminJapan.”Vet.Microbiol.2010:140:147–154，而BoNTFA由BoNTF5轻链，与亚型F1密切相关的HN结构域和BoNTA1HC结构域组成Pellett，Sabine等人，"PurificationandCharacterizationofBotulinumNeurotoxinFAfromaGeneticallyModifiedClostridiumbotulinumStrain."mSphere1.12016:e00100-15。在一个实施方案中，切割VAMP的梭菌神经毒素是选自BoNTDC和BoNTFA的镶嵌神经毒素。在一个实施方案中，切割VAMP的梭菌神经毒素是嵌合chimeric神经毒素。本文所用的术语“嵌合神经毒素”是指这样的神经毒素，其包含一个或多个源自第一神经毒素的结构域和一个或多个源自第二神经毒素的结构域。例如，嵌合神经毒素可包含源自第一神经毒素的LHN结构域和源自第二神经毒素的HC结构域。嵌合神经毒素的另一个实例是这样的神经毒素，其包含源自第一神经毒素的LHNHCN结构域和源自第二神经毒素的HCC结构域。嵌合神经毒素的实例在GB1607901.4尚未公开中提供，其通过引用并入本文。在一个实施方案中，切割VAMP的梭菌神经毒素是嵌合神经毒素，其包含：-来自BoNTB，BoNTD，BoNTF，BoNTG，BoNTX或TeNT的轻链L，-来自BoNTA，BoNTB，BoNTC，BoNTD，BoNTE，BoNTF，BoNTG，BoNTX或TeNT的HN结构域，-来自BoNTA，BoNTB，BoNTC，BoNTD，BoNTE，BoNTF，BoNTG，BoNTX或TeNT的HCN结构域，-来自BoNTA，BoNTB，BoNTC，BoNTD，BoNTE，BoNTF，BoNTG，BoNTX或TeNT的HCC结构域，其中至少两个结构域来自不同的梭菌神经毒素。在一个实施方案中，切割VAMP的梭菌神经毒素是嵌合神经毒素，其包含：-来自选自BoNTB，BoNTD，BoNTF，BoNTG，BoNTX或TeNT的第一种梭菌神经毒素的LHN结构域，-来自选自BoNTA，BoNTB，BoNTC，BoNTD，BoNTE，BoNTF，BoNTG，BoNTX或TeNT的第二种梭菌神经毒素的HCNHCC结构域，其中第一和第二梭菌神经毒素是不同的。在一个实施方案中，切割VAMP的梭菌神经毒素是嵌合神经毒素，其包含：-来自选自BoNTB，BoNTD，BoNTF，BoNTG，BoNTX或TeNT的第一种梭菌神经毒素的LHNHCN结构域，-来自选自BoNTA，BoNTB，BoNTC，BoNTD，BoNTE，BoNTF，BoNTG，BoNTX或TeNT的第二种梭菌神经毒素的HCC结构域，其中第一和第二梭菌神经毒素是不同的。切割VAMP的梭菌神经毒素可以是修饰的神经毒素或其衍生物，包括但不限于下面描述的那些。修饰的神经毒素或衍生物可含有一种或多种氨基酸，其与天然未修饰的形式的神经毒素相比已被修饰，或可含有一个或多个插入的氨基酸，其不存在于天然未修饰的形式的毒素中。举例来说，相对于天然未修饰的梭菌神经毒素序列，修饰的梭菌神经毒素可在一个或多个结构域中具有修饰的氨基酸序列。此类修饰可以修饰神经毒素的功能方面，例如生物活性或持久性。如本文所述的修饰的切割VAMP的梭菌神经毒素保留了与靶细胞上的受体结合，将轻链转移到细胞质中并切割VAMP的能力。修饰的切割VAMP的梭菌神经毒素可以在重链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰例如修饰的HC结构域，其中所述修饰的重链以比天然未修饰的神经毒素更高或更低的亲和力结合靶神经细胞。HC结构域中的此类修饰可包括修饰神经节苷脂结合位点或HCC结构域的蛋白质受体结合位点中的残基，其改变与神经节苷脂受体和或靶神经细胞的蛋白质受体的结合。此类修饰的神经毒素的实例描述于WO2006027207和WO2006114308中，这两篇文献均通过引用整体并入本文。例如，来自BoNTB神经毒素的HCC结构域包含至少一个氨基酸残基取代、添加或缺失，其具有与天然BoNTBHCC序列相比增加BoNTBHCC结构域对人SytII的结合亲和力的作用。BoNTBHCC亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失已在WO2013180799和尚未公布的PCTUS2016024211中公开均通过引用并入本文。HCC亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失包括选自下组的取代突变：V1118M；Y1183M；E1191M；E1191I；E1191Q；E1191T；S1199Y；S1199F；S1199L；S1201V；E1191C，E1191V，E1191L，E1191Y，S1199W，S1199E，S1199H，W1178Y，W1178Q，W1178A，W1178S，Y1183C，Y1183P及其组合。在一个实施方案中，切割VAMP的梭菌神经毒素是重新靶向的神经毒素。本文所用的术语“重新靶向的神经毒素”也称为“靶向分泌抑制剂”，“TSI”，“TVEMP”或“TEM”是指包含与非梭菌受体结合的靶向部分TM的梭菌神经毒素。TM可以替代梭菌神经毒素重链的部分或全部HC或HCC结构域。重新靶向的神经毒素的实例公开于WO9633273，WO9807864，WO0010598，WO0121213，WO0153336；WO0207759，WO2005023309，WO2006026780，WO2006099590，WO2006056093，WO2006059105，WO2006059113，WO2007138339，WO2007106115，WO2007106799，WO2009150469，WO2009150470，WO2010055358。，WO2010020811，WO2010138379，WO2010138395，WO2010138382，WO2011020052，WO2011020056，WO2011020114，WO2011020117，WO201120119，WO2012156743，WO2012134900，WO2012134897，WO2012134904，WO2012134902，WO2012135343，WO2012135448，WO2012135304，WO2012134902，WO2014033441，WO2014128497，WO2014053651，WO2015004464，所有这些文献均通过引用并入本文。适用于本发明方法或用途的细胞的实例包括原核细胞，例如大肠杆菌细胞，酵母细胞，昆虫细胞，动物细胞，哺乳动物细胞，人细胞，小鼠细胞，灵长类动物细胞和或神经元细胞。优选地，细胞是神经元细胞，特别是对BoNT具有高敏感性的细胞。对BoNT具有高敏感性的细胞是易受BoNT中毒影响的细胞。在一些实施方案中，对BoNT具有高敏感性的细胞是对例如，通过约500pM或更小，约400pM或更小，约300pM或更小，约200pM或更小，约100pM或更小，约90pM或更小，约80pM或更小，约70pM或更小，约60pM或更小，约50pM或更小，约40pM或更小，约30pM或更小，约20pM或更小，约10pM或更小，约9pM或更小，约8pM或更小，约7pM或更小，约6pM或更小，约5pM或更小，约4pM或更小，约3pM或更小，约2pM或更小，约1pM或更小，约0.9pM或更小，约0.8pM或更小，约0.7pM或更小，约0.6pM或更小，约0.5pM或更小，约0.4pM或更小，约0.3pM或更小，约0.2pM，约0.1pM或更小，约90fM或更小，约80fM或更小，约70fM或更小，约60fM或更小，约50fM或更小，约40fM或更小，约30fM或更小，约20fM或更小，或约10fM或更小的BoNT中毒敏感的细胞。优选地，细胞对切割VAMP的BoNT具有高灵敏度如上所定义。在一个实施方案中，细胞是对BoNT具有高度敏感性的原代神经元细胞，例如皮质神经元、海马神经元和或脊髓神经元。例如，细胞是大鼠皮质神经元。在一个实施方案中，细胞来自对BoNT具有高敏感性的神经元细胞系，例如BE2-M17，Kelly，LA1-55n，N1E-115，N4TG3，N18，Neuro-2a，NG108-15，PC12，SH-SY5Y，SiMa和或SK-N-BE2-C。在一个实施方案中，细胞是源自干细胞的神经元细胞，特别是来自诱导的多能干细胞iPS细胞的神经元细胞，例如神经元，DopaNeuronsiCell谷氨酸能神经元，iCellMotoNeurons细胞动力学公司大脑皮层神经元，神经干细胞AxolBiosciences，Peri.4U神经元，CNS.4U神经元，Dopa.4UNeuronsAxiogenesis，MNP细胞Lonza，皮层神经元，运动神经元iStem和或iPSC衍生的神经细胞MTI-GlobalStem。在一个实施方案中，可以通过重组技术修饰细胞以表达高水平的VAMP，例如VAMP1，VAMP2VAMP3，VAMP4，VAMP5和或YKT6，更优选VAMP1，VAMP2和或VAMP3。在其中切割VAMP的神经毒素是BoNTB，BoNTDC或BoNTG的一个实施方案中，细胞表达高水平的突触结合蛋白I和或突触结合蛋白IISytISytII。在其中切割VAMP的神经毒素是BoNTB，BoNTDC或BoNTG的一个实施方案中，通过重组技术修饰细胞以表达高水平的突触结合蛋白I和或突触结合蛋白IISytISytII。在其中切割VAMP的神经毒素是BoNTFA，BoNTF，BoNTD或TeNT的一个实施方案中，细胞表达高水平的突触小泡蛋白SV2。在其中切割VAMP的神经毒素是BoNTFA，BoNTF，BoNTD或TeNT的一个实施方案中，通过重组技术修饰细胞以表达高水平的突触小泡蛋白SV2。如本文所用，“适合梭菌神经毒素活性的条件”是指梭菌神经毒素可与细胞膜上存在的梭菌神经毒素受体结合，将梭菌神经毒素轻链转移到细胞质和切割VAMP的条件例如温度、pH、辅因子等。在本发明方法的一个实施方案中，适合梭菌神经毒素活性的条件可包括在约37℃温育约1小时至约48小时的时间。在本发明方法的一个实施方案中，适合梭菌神经毒素活性的条件可包括在约37℃温育约2小时至约36小时的时间。在本发明方法的一个实施方案中，适合梭菌神经毒素活性的条件可包括在约37℃温育约4小时至约24小时的时间。例如，适合梭菌神经毒素活性的条件可包括在37℃下温育24小时。如本文所用，“适合于第一检测抗体与切割的VAMP结合的条件”和“适合于第二检测抗体与全长VAMP结合的条件”是指其中第一和或第二检测抗体可以与切割的VAMP和或全长VAMP结合的条件例如温度、pH、辅因子等。在本发明方法的一个实施方案中，适于抗体结合的条件可包括在约4℃温育约8小时至约48小时的时间。在本发明方法的一个实施方案中，适于抗体结合的条件可包括在约4℃温育约10小时至约24小时的时间。在本发明方法的一个实施方案中，适于抗体结合的条件可包括在约4℃温育约12小时至约16小时的时间。在本发明方法的一个实施方案中，适合抗体结合的条件可包括在约25℃温育约30分钟至约8小时的时间。在本发明方法的一个实施方案中，适合抗体结合的条件可包括在约25℃温育约1小时至约4小时的时间。在本发明方法的一个实施方案中，适于抗体结合的条件可包括在约25℃温育约1.5小时至约3小时的时间。适用于检测和定量检测抗体与切割或全长VAMP结合的方法是本领域熟知的。例如，可以通过蛋白质印迹检测和定量检测抗体与切割的或全长的VAMP的结合。当每种蛋白质通过SDS-PAGE以特定分子量运行时，将以比全长VAMP更低的分子量检测切割的VAMP。通过光密度测定法对条带的分析允许使用凝胶上相同泳道内的全长条带和切割条带的百分比切割读数。或者，可以使用酶联免疫吸附测定ELISA，例如夹心ELISA检测和定量VAMP切割。在本发明方法的一个实施方案中，第一检测抗体是多克隆抗体，并且在酶联免疫吸附测定中检测并定量第一检测抗体与C端VAMP切割产物的结合。在本发明方法的一个实施方案中，第一检测抗体是多克隆抗体，并且在蛋白质印迹测定中检测并定量第一检测抗体与C末端VAMP切割产物的结合。在本发明方法的一个实施方案中，第一检测抗体是单克隆抗体，并且在酶联免疫吸附测定中检测并定量第一检测抗体与C端VAMP切割产物的结合。在本发明方法的一个实施方案中，第一检测抗体是单克隆抗体，并且在蛋白质印迹测定中检测并定量第一检测抗体与C末端VAMP切割产物的结合。在本发明方法的一个实施方案中，在细胞质内容物与检测抗体接触之前裂解细胞。在本发明方法的备选实施方案中，细胞在其细胞质内容物与检测抗体接触之前被透化。另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含易受切割VAMP的神经毒素中毒的细胞；和针对切割的VAMP的第一检测抗体，其中所述第一检测抗体是本发明的抗体。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含第二检测抗体，其与全长VAMP结合但不与C-末端VAMP切割产物结合。合适地，第二检测抗体与梭菌神经毒素切割位点N末端的VAMP表位结合。合适的抗体的实例包括市售抗体，例如ab3347Abcam或ab181869Abcam。本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于实践或测试本公开的实施方案。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列以5'至3'方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基取向从左至右书写。在提供一系列值的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一。在所述范围内的任何所述值或中间值与所述范围内的任何其他所述或中间值之间的每个较小范围都包含在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或在该范围内排除，并且在该较小范围内包括任一个、没有或两个极限的每个范围也包括在本公开内容中，受限于在所述范围中任何特别排除的极限。在所述范围包括一个或两个极限的情况下，排除那些被包括的极限之一或两者的范围也包括在本公开中。必须注意的是，除非上下文另有明确说明，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数参照。因此，例如，提及“一个梭菌神经毒素”包括多种这样的候选剂，并且提及“该梭菌神经毒素”包括提及一种或多种梭菌神经毒素及其本领域技术人员已知的等同物等。现在将参照以下附图和实施例仅通过举例描述本发明。附图图1-具有梭菌神经毒素切割位点的VAMP序列。A具有BoNTF5和BoNTFA，BoNTF，BoNTD和BoNTDC，BoNTB，BoNTG，TeNT和BoNTX切割位点的人和大鼠VAMP1，VAMP2和VAMP3序列。B具有BoNTX切割位点的人和大鼠VAMP4，VAMP5和YKT6序列。图2-具有Ab表位即免疫原性表位区域和BoNTF，BoNTD和BoNB切割位点的VAMP序列。显示人和大鼠VAMP1，VAMP2和VAMP3的序列用于比较。大鼠和人VAMP2序列在所选择的表位区域中是相同的。切割位点用箭头表示：BoNTF和BoNTD的VAMP2切割点分别位于相邻氨基酸Q58-K59和K59-L60上，而BoNTB的切割点位于氨基酸Q76-F77基于人VAMP2序列氨基酸位置上。图3-用MBP-LF和LHND对重组VAMP2-GFP进行无细胞切割。将重组VAMP2-GFP与0.01μgμlLHND或MBP-LF在37℃温育1小时。加入等体积的样品缓冲液，通过SDS-PAGE运行0.5μg考马斯和0.3μg印迹蛋白质，并用考马斯染色或用各种抗VAMP2抗体印迹。草图表示抗体表位的位置。重组蛋白的表示和表位的线长度未按比例绘制。1-BSA，2-VAMP2-GFP，3-切割的VAMP2-GFPaa5960-末端，4-切割的VAMP2-GFPaa1-5859。图4-BoNTF和BoNTD处理后的体外VAMP切割。在96孔板中生长的大鼠皮质神经元直至DIV18-21用BoNTFA或BoNTDB处理24小时。通过SDS-PAGE电泳裂解物并用定制的抗VAMP2抗体印迹：抗Pep1，抗Pep2或抗Pep3，或用商业抗体ab1818691-全长VAMP2，2-切割的VAMP2印迹。抗pep2数据显示全长VAMP2的剂量依赖性消失和低分子量切割片段的出现。两个带信号用于量化BoNTFC和BoNTDD对VAMP2切割的剂量依赖性百分比。图5-A用天然BoNTF1，天然BoNTA1●或重组BoNTFAΔ处理大鼠皮质神经元24小时。裂解细胞，在SDS-PAGE上电泳并进行VAMP-2或SNAP-25切割的印迹。通过光密度分析从全长与切割蛋白的比例确定SNARE切割百分比。使用四参数逻辑方程拟合数据，并测定50％最大SNARE切割pEC50所需的BoNT浓度B。数据是平均值±s.e.m.n＝3BoNTF1和BoNTA1或4BoNTFA独立实验，一式三份。图6-BoNTB和BoNTF处理后的体外VAMP切割。生长至DIV18-21的大鼠皮层神经元用BoNTF或BoNTB处理24小时。通过SDS-PAGE电泳裂解物并用新定制的抗VAMP2抗体抗Pep4，BoNTB切割特异性抗VAMP2抗体或抗Pep1，抗Pep2或抗Pep3抗体印迹。实施例实施例1：通过BoNTD和BoNTF检测VAMP蛋白水解切割A-方法1.抗体生成Eurogentec使用他们的Speedy28天计划https:secure.eurogentec.comproductresearch-anti-protein-28-day-speedy-polyclonal-packages.html？country＝gbr生成抗体。用以下肽以每个肽两只兔子来进行免疫：-VAMPPEP1：H2N-SNRRLQQTQAQVDEC-CONH2SEQIDNO：39；-VAMPPEP2：AcNH-KLSELDDRADALQ-CONH2SEQIDNO：15；或-VAMPPEP3：H2N-CLQAGASQ-CONH2SEQIDNO：40。动物进行第一次免疫和三次后续加强免疫。进行免疫前取血，中间取血和最终取血。2.重组蛋白质切割如前所述产生含有BoNTD的轻链和易位结构域或与麦芽糖结合蛋白MPB融合的等同BoNTF结构域的活性构建体Masuyer等人，“StructureandactivityofafunctionalderivativeofClostridiumbotulinumneurotoxinB.JStructBiol”,174,p52-57,2011；Sutton等人，“PreparationofspecificallyactivatableendopeptidasederivativesofClostridiumbotulinumtoxinstypeA,B,andCandtheirapplications.ProteinExpressionandPurification40:31–41,2005。简而言之，LHNDSEQIDNO：35或称为MBP-LFSEQIDNO：36的融合蛋白后者是MBP与BoNTF1轻链和C-末端6-组氨酸基序的融合体，并且MPB和6-组氨酸基序是通常已知的亲和标签在测定缓冲液50mMHEPESpH7.2，200μMZnCl2，1μgμlBSA，10mMDTT中稀释至0.01μgμl。将VAMP2-GFPSEQIDNO：37人VAMP2的氨基酸2-94和可检测标记绿色荧光蛋白GFP的融合蛋白在测定缓冲液50mMHEPESpH7.2，200μMZnCl2，1μgμlBSA，10mMDTT中稀释至8μM。将等体积的LHND或MBP-LF和VAMP2-GFPSEQIDNO：378μM合并，并在37℃下温育1小时。通过加入2x还原样品缓冲液NuPageLDS样品缓冲液，100mMDTT终止反应。3.大鼠皮层神经元细胞培养从E17-E18CD大鼠胚胎制备大鼠皮质神经元。将解剖的皮质组织收集到冰冷的Hank's平衡盐溶液HBSSwoCa2+或Mg2+中，然后按照制造商的说明书WorthingtonBiochemical，NJ，US在37℃下在木瓜蛋白酶溶液中解离40分钟。将皮质细胞以20,000个细胞孔的密度接种在聚-L-鸟氨酸PLO包被的96孔板上，在125μl含有2％B27补充物，0.5mMGlutaMAX，1％胎牛血清FBS和100Uml青霉素链霉素的Neurobasal培养基中。将细胞保持在37℃，含有5％CO2的潮湿气氛中。在DIV体外天数4时，加入另外125μl含有2％B27，0.5mMGlutaMAX的Neurobasal培养基。通过每周两次更换半培养基维持细胞。在DIV11时，向培养基中加入1.5μM胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷AraC以防止非神经元细胞的增殖。4.BoNT治疗用浓度范围的天然BoNTF1Metabiologics，US1nM-0.1pM或BoNTDMetabiologics，US10nM-1pM在37℃下一式三份的孔中处理DIV18-21的大鼠皮层神经元24小时。除去培养基，用PBS洗涤细胞一次。将细胞在40μlLRS样品缓冲液NuPageLDS缓冲液，1mMDTT，1：500Benzonase中在室温下裂解10分钟。5.SDS-PAGE和蛋白质印迹将神经元裂解物在90℃下煮沸5分钟。每个泳道加载15μl裂解物至12％Bis-Tris凝胶，并在200μV的MES缓冲液中运行50min。使用低MW程序通过TransblotTurboBiorad将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。将膜在室温下用5％低脂乳PBS-Tween封闭1小时，然后与定制的抗Pep1，抗Pep2或抗Pep3抗VAMP2一级抗体或与商业抗VAMP2抗体Abcamab3347和ab181869一起在4℃过夜温育。将膜在PBS-Tween中洗涤3次，并与抗兔-HRP二级抗体在室温下温育1小时。将膜在PBS-Tween中洗涤3×5分钟，然后用SuperSignalWestFemto化学发光底物显色，并使用SyngenePXi系统显现。B-结果重组蛋白检测的评估图2中示出了来自VAMP2的所选三个肽表位相对于BoNT切割位点的区域。显示了人和大鼠VAMP1，VAMP2和VAMP3的序列用于比较。大鼠和人VAMP2序列在所选择的表位区域中是相同的。BoNTB和BoNTD的切割位点位于相邻的氨基酸上。最初，使用重组VAMP2-GFP在无细胞试验中测试抗体。含有毒素的酶促轻链结构域的BoNTF和BoNTD替代物MBP-LF和LHND用于切割VAMP蛋白图3。另外，使用另外两种市售的VAMP2抗体ab3347表位aa1-18和ab181869aa1-100内的表位作为比较。图3显示抗Pep1抗体检测到全长VAMP2和N-末端切割部分aa1-5859，信号大大减少。如所预期的，该抗体没有检测到C末端切割产物，因为其表位不在该部分上。抗Pep2和抗Pep3抗体检测到VAMP2-GFP的全长蛋白质和C末端切割产物。Ab3347仅检测到全长VAMP2而未检测到N末端切割片段，而ab181869检测到两者。这些第一结果表明所述抗体能够检测重组VAMP2的全长和预期的切割产物。例外是ab3347，其仅检测到全长VAMP2而不是N末端切割片段。内源性蛋白质检测的评估接下来的问题是这些抗体是否能够在神经细胞测定中检测到任何的切割产物，在所述神经细胞测定中将存在内源蛋白酶。用BoNTF或BoNTD处理大鼠原代皮质神经元并裂解用于WB分析图4。抗Pep1抗体仅识别全长蛋白质，并且没有可检测的切割产物。抗Pep2抗体检测到全长和C末端切割的产物。抗Pep3抗体在细胞裂解物中显示出对单体VAMP非常差的亲和力的弱信号，并且检测到最可能是二聚体和其他蛋白质的更高分子量种类数据未示出。全长单体信号非常低，但是存在BoNTF和BoNTD切割的C-末端产物的条带。换句话说，抗Pep3不检测全长VAMP，但弱检测到BoNTF和BoNTD切割的C末端片段。这与早期的无细胞结果形成对比，后者显示来自全长和切割的重组VAMP的强信号。由于在无细胞试验中不存在切割的蛋白检测，因此未在体外测试商业抗体Ab3347。尽管在无细胞试验中与N-末端切割的重组片段具有阳性结合，但商业抗体ab181869在皮质裂解物中检测到全长VAMP2，但在皮质裂解物中未检测到切割的片段。Pep2数据用于量化BoNTF图4C和BoNTD图4D对VAMP2的剂量依赖性切割。本发明人最初表明，在无细胞系统中，可以检测两种重组VAMP切割产物。然而，当转移至细胞裂解物时，发明人还表明N端产物是不可检测的，但除了降解之外，还可能存在其他尚未知的机制。相反，本发明人已经表明，仍然与囊泡膜结合的C-末端VAMP片段不会以防止抗体结合和Western印迹检测的方式降解或改变。Pep2表位与BoNTD和BoNTF切割位点相邻并且针对该肽产生的抗体检测全长VAMP和切割产物。相反，针对更远离BoNTFD切割位点的较短表位产生的抗Pep3抗体也检测到切割产物，尽管是弱的。实施例2：在大鼠皮质神经元中检测BoNTFA和BoNTF1的VAMP蛋白水解切割A-方法1.大鼠皮层神经元细胞培养如实施例1中详述的制备大鼠皮质神经元。2.BoNT处理在一式三份孔中，在37℃下用浓度范围1pM-1fM的重组BoNTFASEQIDNO：38或浓度范围1nM-1pM的天然BoNTF1Metabiologics，US或浓度范围1nM-1fM的天然BoNTA1ListBiologicalLaboratoriesInc.，US处理DIV18-21的大鼠皮层神经元24小时。除去培养基，用PBS洗涤细胞一次。将细胞在40μlLRS样品缓冲液NuPageLDS缓冲液，1mMDTT，1：500Benzonase中在室温下裂解10分钟。3.大鼠皮层神经元的SDSPage和Western印迹在室温下将大鼠皮质神经元在40μl裂解缓冲液NuPageLDS样品缓冲液，1mMDTT和1：500Benzonase中裂解10分钟。将样品在90℃下煮沸5分钟，每个泳道加入15μl裂解物至12％Bis-Tris凝胶，并在MOPS缓冲液中在200V下运行80minSNAP-25或MES缓冲液在200V下运行50minVAMP2。使用混合MWSNAP25或低MWVAMP2程序，通过TransblotTurboBiorad将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。将膜在室温下用5％低脂乳PBS-Tween封闭1小时，然后与抗SNAP25抗体SigmaS96841：4000或抗Pep21：500，一种如实施例1中所述的定制的抗体-VAMP2Eurogentec抗体一起温育；将每种一级抗体在4℃温育过夜。将膜在PBS-Tween中洗涤3次，并与抗兔-HRP二级抗体在室温下温育1小时。将膜在PBS-Tween中洗涤3×5min，然后用SuperSignalWestDura或WestFemto化学发光底物显色，并使用SyngenePxi系统显现。使用Genetools软件分析条带光密度测定法，并使用SNAP-25和VAMP2的全长蛋白质与切割产物的比率来测定％蛋白质切割。B-结果用BoNTF1，BoNTA1或BoNTFA处理24小时后，裂解大鼠皮质神经元，在SDS-PAGE上电泳并对VAMP-2BoNTF1和BoNTFA或SNAP-25BoNTA1进行Western印迹。通过光密度测定法分析从全长与切割蛋白的比例来确定SNARE切割百分比。结果如图5所示。重组BoNTFA切割的VAMP-2，效力pEC50＝12.75±0.14，n＝4。天然BoNTF1切割的VAMP-2，效力pEC50＝10.77±0.12，n＝3。天然BoNTA1切割的SNAP-25，效力pEC50＝12.38±0.14，n＝3。实施例3：在大鼠皮质神经元中检测BoNTB的VAMP蛋白水解切割A-方法1.抗体生成Abcam使用用肽Pep4：FETSAAKLKRKYWWKSEQIDNO：49免疫的兔产生单克隆抗体。BoNTB切割特异性抗VAMP2抗体Kegel等人，ToxicologyinVitro；2007,21：p1641-1649用于比较研究。2.大鼠皮层神经元细胞培养从E17-E18CD大鼠胚胎制备大鼠皮质神经元。将解剖的皮质组织收集到冰冷的Hank's平衡盐溶液HBSSwoCa2+或Mg2+中，然后按照制造商的说明书WorthingtonBiochemical，NJ，US在37℃下在木瓜蛋白酶溶液中解离40分钟。将皮质细胞以20,000个细胞孔的密度接种在聚-L-鸟氨酸PLO包被的96孔板上，在125μl含有2％B27补充物，0.5mMGlutaMAX，1％胎牛血清FBS和100Uml青霉素链霉素的Neurobasal培养基中。将细胞保持在37℃，含有5％CO2的潮湿气氛中。在DIV体外天数4时，加入另外125μl含有2％B27，0.5mMGlutaMAX的Neurobasal培养基。通过每周两次更换半培养基维持细胞。在DIV11时，向培养基中加入1.5μM胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷AraC以防止非神经元细胞的增殖。3.BoNT治疗将大鼠皮质神经元在T25烧瓶中培养，并用1nM和10pM的BoNTB由ListBiologicalLaboratories，Inc.提供SEQIDNO：2在37℃处理24小时。除去培养基，用PBS洗涤细胞一次。将细胞在1.5mlNuPage样品缓冲液NuPageLDS缓冲液，1mMDTT，1：500Benzonase中在室温下裂解10分钟。4.SDS-PAGE和Western印迹将神经元裂解物在90℃下煮沸5分钟。每个泳道加入15μl裂解物至12％Bis-Tris凝胶，并在200μV的MES缓冲液中运行50分钟。使用低MW程序通过TransblotTurboBiorad将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。将膜在室温下用5％低脂乳PBS-Tween封闭1小时，然后与定制的抗Pep1，抗Pep2，抗Pep3或抗Pep4抗体或与BoNT-B切割特异性抗体一起温育，在4℃过夜。将膜在PBS-Tween中洗涤3次，并与抗兔-HRP二级抗体在室温下温育1小时。将膜在PBS-Tween中洗涤3×5分钟，然后用SuperSignalWestFemto化学发光底物显色，并使用SyngenePXi系统显现。B-结果基于在上述实施例1和2中获得的结果，其暗示表位的位置是体外检测切割的VAMP的关键，产生针对位于C-末端侧上BoNTB切割位点附近的表位的新的单克隆抗体。在BoNTB和BoNTF处理后，在相同的大鼠皮层测定中测试该抗体，并与抗Pep1，抗Pep2，抗Pep3和BoNTB切割特异性抗体进行比较图6。所有比较抗体的表位区域位于BoNTB切割位点的N末端侧。图6显示针对Pep4的新抗体表位的位置使得能够检测全长VAMP2，以及用于BoNTB和BoNTF处理的切割产物。相反，抗Pep2和抗Pep3抗体仅检测到BoNTF切割产物，但未检测到BoNTB切割产物。抗Pep1抗体未检测到任何预期的裂解产物。BoNTB切割特异性抗体也未在这些细胞裂解物中检测到任何BoNTB切割产物。总之，本数据显示切割的VAMP检测的重要考虑因素是抗体表位的位置。只有针对切割后位于膜结合的VAMP片段上的表位产生的抗体才能够检测到该片段。通过将单克隆抗体表位定位于VAMP的C末端，假设该区域应存在于由切割VAMP的神经毒素血清型B，D和F产生的VAMP片段中。事实证明是这种情况，使得能够产生单一抗体抗Pep4Mab，其为BoNTB和BoNTF处理的神经元提供阳性结果。此外，由于TeNT与BoNTB具有相同的切割位点，并且BoNTD切割位点与BoNTF切割位点紧密相邻，因此预期该抗体也适用于TeNT和BoNTD切割。Pep4表位区域的另一个优点是针对该区域的抗体可以以相似的灵敏度检测全长和切割的VAMP。同时检测同一样品中的两种蛋白质形式的能力提供了用于归一化的强大工具，而无需额外的管家蛋白质的印迹。这提供了非常有用且直接的信号增益蛋白质印迹分析，用于定量细胞模型中的BoNT效力。本数据还显示了无细胞重组蛋白测定和全细胞模型之间VAMP检测的差异。正是这种无法检测细胞切割的VAMP构成了细胞中VAMP降解发生得非常快的假说的基础Foran等人，“EvaluationofthetherapeuticusefulnessofbotulinumneurotoxinB,C1,EandFcomparedwiththelong-lastingtypeA”.J.BiolChem2782pp1363–13712003。与本发明的抗体相反，大多数商业上可获得的VAMP抗体针对蛋白质N-末端区域内的表位产生，因此N-末端VAMP片段是那些早期研究的焦点。尽管本文显示较小的C-末端VAMP片段在细胞中不降解，但也未检测到较大的N-末端片段。然而有趣的是，无细胞结果显示，即使它存在于缺乏任何蛋白酶的无细胞系统中，并非所有商业抗体都能够检测到预期的N-末端片段。从目前的数据可以得出结论，VAMP降解假说最肯定仅与N末端片段有关，并且C末端VAMP片段不降解并保持与囊泡膜结合。序列信息·SEQIDNO:1-BoNTA1-UniProtKB登录号P10845肉毒杆菌MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL·SEQIDNO:2-BoNTB1-UniProtKB登录号P10844肉毒杆菌MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISK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权利要求：1.一种包含VAMP表位的抗原多肽，其中所述抗原多肽由10至65个氨基酸残基组成，其中所述VAMP表位包含与包含至少8个氨基酸残基的VAMP序列有至少90％同一性的氨基酸序列，所述至少8个氨基酸残基直接位于所述VAMP中梭菌神经毒素切割位点的C-末端。2.根据权利要求1的抗原多肽，其中所述多肽由10至17个氨基酸残基，优选10至16个氨基酸残基，更优选10至15个氨基酸残基组成。3.根据权利要求1或2的抗原多肽，其中所述VAMP选自VAMP1、VAMP2、VAMP3、VAMP4、VAMP5和或YKT6。4.根据权利要求1至3中任一项的抗原多肽，其中所述VAMP表位包含或组成为与选自SEQIDNO：15至SEQIDNO：34，和SEQIDNO：48至SEQIDNO：78的VAMP序列有至少90％同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求1至4中任一项的抗原多肽，其中所述VAMP表位是VAMP1、VAMP2和或VAMP3表位，并且选自：-包含或组成为KLSELDDRADALQSEQIDNO：15的BoNTF或BoNTDVAMP表位；-包含或组成为ERDQKLSELDDRASEQIDNO：32的BoNTF5或BoNTFAVAMP表位；·包含或组成为FETSAAKLKRKYWSEQIDNO：22或FETSAAKLKRKYWWKSEQIDNO：49的BoNTB或TeNTVAMP表位；-包含或组成为AKLKRKYWWKNSEQIDNO：27的BoNTGVAMP表位；和-包含或组成为ADALQAGASQFSEQIDNO：53的BoNTXVAMP表位。6.根据权利要求1至4中任一项的抗原多肽，其中所述VAMP表位是VAMP4、VAMP5和或YKT6表位，并且选自：-包含或组成为SESLSDNATAFSEQIDNO：62，SDQLLDMSSTFSEQIDNO：66或SEVLGTQSKAFSEQIDNO：75的BNTXVAMP表位。7.一种包含前述权利要求中任一项的抗原多肽的多肽，其中所述多肽不包含大于17，优选16，更优选15个连续氨基酸的区域，所述连续氨基酸与天然存在的VAMP氨基酸序列具有100％序列同一性。8.一种抗原蛋白，其包含根据权利要求1至6中任一项的多肽，或根据权利要求7的多肽，所述抗原蛋白与载体共价连接。9.根据权利要求1至6中任一项的抗原多肽、或根据权利要求7的多肽、或根据权利要求8的抗原蛋白用于产生针对C末端VAMP切割产物的抗体的用途。10.一种抗体，其结合根据权利要求1至6中任一项的抗原多肽，或根据权利要求7的多肽，或根据权利要求8的抗原蛋白。11.根据权利要求10的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。12.根据权利要求10的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。13.根据权利要求10至12中任一项的抗体，其中所述抗体与所述表位之间的KD低于10-7M。14.根据权利要求10至13中任一项的抗体在信号增益细胞测定中的用途，所述细胞测定用于通过切割VAMP的梭菌神经毒素进行VAMP切割。15.一种测定在细胞中切割VAMP的梭菌神经毒素对VAMP的切割的方法，包括：a.在适合梭菌神经毒素活性的条件下，使细胞与梭菌神经毒素接触；b.在通过切割VAMP的梭菌神经毒素切割VAMP之后，使所述细胞的细胞质内含物与针对C-末端VAMP切割产物的第一检测抗体在适合于第一检测抗体与C末端VAMP切割产物结合的条件下接触，其中所述第一检测抗体是根据权利要求10-13中任一项的抗体；和c.通过适合的手段检测所述第一检测抗体与所述C末端VAMP切割产物的结合。16.根据权利要求15的方法，还包括d通过适合的手段定量与所述第一检测抗体结合的C末端VAMP切割产物的量。17.一种测定受试者中切割VAMP的梭菌神经毒素的免疫抗性的方法，包括：a.向从受试者获得的测试样品中加入切割VAMP的梭菌神经毒素；b.在适合梭菌神经毒素活性的条件下，使细胞与步骤a的测试样品接触；c.在通过切割VAMP的梭菌神经毒素切割VAMP之后，使所述细胞的细胞质内含物与针对C-末端VAMP切割产物的第一检测抗体在适合于所述第一检测抗体与C末端VAMP切割产物结合的条件下接触，其中所述第一检测抗体是根据权利要求10-13中任一项的抗体；d.通过适合的手段检测第一检测抗体与C末端VAMP切割产物的结合；e.定量与第一检测抗体结合的C末端VAMP切割产物的量；f.用阴性对照样品代替测试样品重复步骤a至e；和g.比较步骤e和f中与所述第一检测抗体结合的C-末端VAMP切割产物的量，其中相对于在步骤f中与所述第一检测抗体结合的C-末端VAMP切割产物的量，在步骤e中检测到与所述第一检测抗体结合的较低量的C-末端VAMP切割产物表明存在针对切割VAMP的梭菌神经毒素的中和抗体。18.一种试剂盒，其包含易受切割VAMP的神经毒素中毒的细胞；和一种针对切割的VAMP的第一检测抗体，其中所述第一检测抗体是根据权利要求10-13中任一项的抗体。

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