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申请/专利权人：新疆农业大学

摘要：本发明适用于植物遗传技术领域，提供了一种基于转录组测序的棉花耐盐基因发现方法。本发明并确定了11个棉花耐盐基因：Ghir_A01G013620、Ghir_D02G020200、Ghir_D05G005640、Ghir_A06G003750、Ghir_D06G003700、Ghir_D12G026490、Ghir_A03G022170、Ghir_A02G002100、Ghir_A04G008730、Ghir_A09G007820、Ghir_A09G011700。这些基因在棉花的盐分防御机制中发挥着重要作用。本发明为分子育种提供了有价值的遗传资源，有助于培育出更加耐盐的新品种。

主权项：1.一种基于转录组测序的棉花耐盐基因发现方法，其特征在于，所述棉花耐盐基因包括Ghir_A01G013620、Ghir_D02G020200、Ghir_D05G005640、Ghir_A06G003750、Ghir_D06G003700、Ghir_D12G026490、Ghir_A03G022170、Ghir_A02G002100、Ghir_A04G008730、Ghir_A09G007820和Ghir_A09G011700；基因Ghir_A01G013620的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；基因Ghir_D02G020200的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示；基因Ghir_D05G005640的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示；基因Ghir_A06G003750的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.8所示；基因Ghir_D06G003700的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.10所示；基因Ghir_D12G026490的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.12所示；基因Ghir_A03G022170的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.14所示；基因Ghir_A02G002100的核苷酸序列如SEQIDNo.15所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.16所示；基因Ghir_A04G008730的核苷酸序列如SEQIDNo.17所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.18所示；基因Ghir_A09G007820的核苷酸序列如SEQIDNo.19所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.20所示；基因Ghir_A09G011700的核苷酸序列如SEQIDNo.21所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.22所示；棉花耐盐基因的发现方法包括以下步骤：步骤S1、材料种植及样品准备：将陆地棉耐盐材料鲁棉28和敏盐材料中棉所12种子在蒸馏水中浸泡24小时，筛选饱满种子；使用1:1混合的营养土与蛭石填充10×10育苗钵至13高度并压实，每钵播种5粒种子，覆盖营养土至钵高34处；在托盘中存放1L水并用黑色塑料袋保湿，待出苗均匀后去掉塑料袋，每钵保留3株健康幼苗；待棉花长至三叶期时，清洗根部，置于锥形瓶中，用霍格兰营养液缓苗两天；实验组以350mMNaCl处理，对照组使用等量蒸馏水；在0h、2h、5h、12h、24h、48h和72h收集叶片样本，冷冻保存，每组3个重复；步骤S2、文库构建及测序：采用多糖多酚RNA提取试剂盒从样本中提取总RNA；使用NanoDrop2000检测RNA浓度和纯度，使用RNA建库试剂盒生成测序文库；利用AMPureXP磁珠纯化文库片段；然后加入3μlUSER酶，在37℃下孵育15分钟，在PCR前在95℃下反应5分钟，纯化PCR产物并在AgilentBioanalyzer2100系统上评估文库质量；在IlluminaNovaSeq平台上对文库进行测序，生成150bp的双末端序列；步骤S3、测序数据质量控制及分析：去除含有ploy-N的reads和N的比例大于10％的Reads，去除质量值Q≤10的碱基数占整条reads的50％以上的低质量reads，获得Cleanreads；使用Hisat2工具将Cleanreads映射到参考基因组TM-1；通过Blastp使用Nr、KOG、KEGG和GO数据库进行基因功能注释；使用每百万片段映射的转录本每千碱基片段数来估算基因表达水平；步骤S4、差异表达基因筛选及分析：使用DESeq2软件对不同棉花品种和处理组之间进行差异表达分析；错误发现率0.05且差异倍数≥2的基因被指定为差异表达基因；步骤S5、加权基因共表达网络构建：使用“WGCNA”R包构建基因共表达网络；选择错误发现率0.01且差异倍数≥5的差异表达基因，确定软阈值β＝17以构建无尺度网络，使用Cytoscape软件可视化基因模块，筛选得到11个棉花耐盐基因。

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百度查询： 新疆农业大学 一种基于转录组测序的棉花耐盐基因发现方法