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申请/专利权人：重庆市江津区中心医院

摘要：本发明公开了一种基于酶促重组等温扩增检测粪便SFRP2、SEPTIN9DNA甲基化与具核梭杆菌核酸的微流控测试方法，核心在于将ERA‑Cas12a技术结合微流控芯片技术应用于粪便样本SFRP2、SEPTIN9甲基化与具核梭杆菌。ERA‑Cas12a是一种新型的核酸酶，具有高度的特异性和灵敏性，能够在等温条件下实现核酸的快速扩增和检测。通过巧妙地设计特异性引物，本发明使得这些引物能够同时符合甲基化和ERA‑Cas12a技术的要求，从而确保了检测的高效性和准确性。利用微流控技术进行粪便SFRP2、SEPTIN9甲基化与具核梭杆菌核酸，简化了甲基化处理流程，并且让检测结果判读直观简单。

主权项：1.一种基于酶促重组等温扩增检测粪便SFRP2、SEPTIN9DNA甲基化与具核梭杆菌核酸的微流控测试方法，其特征在于：包括以下步骤，S1、样本处理，收集粪便样本，通过加热裂解、磁珠吸附、洗涤、洗脱得到扩增产物；S2、核酸甲基化，将磁棒取出放入有洗脱液的自热管中，温度达到95℃，变性5min，使DNA变为单链，再次用新的磁棒吸附洗脱液，将磁棒放入有亚硫酸氢盐的处理管中16h，最后通过洗涤、洗脱，得到甲基化处理后的核酸；S3、引物设计，设计SFRP2和SEPTIN9的甲基化、非甲基化的引物，设计F.nucleatum引物，其中SFRP2的甲基化、非甲基化的引物序列如表1，表1.SFRP2甲基化、非甲基化引物 SEPTIN9的甲基化和非甲基化引物序列如表2，表2.SEPTIN9甲基化、非甲基化引物 F.nucleatum引物序列如表3，表3.F.nucleatum引物 S4、探针设计与筛选，其中SFRP2甲基化引物探针：5'TTGTGTGTTAGAGTTCGTGATGTTTTCGAGTATTGAGTTATGTTATT3'；SEPTIN9甲基化引物探针：5'GAGGGGAAGAGGAGGAGGATTTTTCGGGGTTGTTAGTGATATTTTT3'；F.nucleatum引物探针：5'AATGGAAGCTACAAGAGAAGAAAATGAAAATGGTATAAGTTATAAAG3'；S5、微流控芯片设计，芯片包括通过孔径0.2cm的管道连通的加样区、ERA扩增区、CRISPR-Cas12a反应区、侧向流结果判读区，其中CRISPR-Cas12a检测区包被有相应的荧光探针；S6、核酸扩增：ERA扩增区分别将筛选后的甲基化SFRP2、SEPTIN9特异性引物与甲基化处理后的核酸，以及具核梭杆菌特异引物与其核酸，利用ERA酶在等温条件下进行快速扩增反应；S7、侧向流试纸条：采用了FAMFITC-生物素报告基因进行免疫层析检测，阳性样品中，金粒抗生物素抗体与高浓度FAMFITC-生物素报告基因充分结合，结合物在检测条带T线被抗FAMFITC抗体拦截，形成显色条带；阴性样本，无完整的FAMFITC-生物素报告基因，金粒抗生物素抗体形成不能被检测条带T线拦截，无显示条带。

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