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申请/专利权人：盐城师范学院

摘要：本发明公开了一种消除沼液农用生物肥料软包装胀气并提高肥效的方法。本发明通过将复合菌剂和CaO2添加到沼液农用生物肥料中，该复合菌剂主要由短小芽胞杆菌BacilluspumilusWP8、恶臭假单胞菌Pseudomonasputidasp.RBP1、不动杆菌Acinetobactersp.A6构成。本发明不仅有效解决了沼液农用生物肥料软包装所存在的高温胀气问题，并且还能有效提高处理后的沼液农用肥效，提高土壤微生物丰度与多样性、浸种以提高植物种子萌发率、抗病害等方面的功效。

主权项：1.一种消除沼液农用生物肥料软包装胀气并提高肥效的方法，其特征在于，该方法为：将复合菌剂和CaO2添加到沼液农用生物肥料中，所述复合菌剂由短小芽胞杆菌BaclluspumilusWP8、恶臭假单胞菌Pseudomonasputidasp.RBP1和不动杆菌Acinetobactersp.A6组成；其中，所述短小芽胞杆菌BacilluspumilusWP8，于2011年8月31日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏编号为CGMCCNo.5206；所述恶臭假单胞菌Pseudomonasputidasp.RBP1，于2011年8月31日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏编号为CGMCCNo.5205；所述不动杆菌Acinetobactersp.A6，于2015年7月2日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏编号为CGMCCNo.11033；所述沼液农用生物肥料中，CaO2的浓度为0.2~0.5gL，短小芽胞杆菌BacilluspumilusWP8菌浓度为106~109cfuL，恶臭假单胞菌Pseudomonasputidasp.RBP1菌浓度为105~108cfuL，不动杆菌Acinetobactersp.A6菌浓度为105~108cfuL。

全文数据：一种消除沼液农用生物肥料软包装胀气并提高肥效的方法技术领域本发明属于农业废物处理技术领域，尤其涉及一种通过化学试剂与复合微生物菌剂联合使用来消除沼液农用生物肥料软包装胀气的方法，以及由沼液农用生物肥料、化学试剂与复合微生物菌剂联合提高肥效的方法。背景技术近年来，国家大力支持和推广养殖粪污等有机废弃物的无害化处理和能源化利用。该举措不但可以消除环境污染，生产清洁能源沼气，产生的沼液和沼渣可以生产有机肥料，适应节能减排和能源可再生利用的发展需求，符合养殖-种植农业循环经济以及国家可持续发展战略。随着该举措的推行，沼气工程特别是大中型沼气工程的逐年增多，产生了大量的沼液和沼渣。固态成分的沼渣一般用于生产有机肥或土壤改良剂，液态成分的沼液产生量大，工艺运行后沼液商品化、直接还田、排放是目前主要形式。沼液中含有丰富的营养元素，氨基酸、腐植酸、生长素、水解酶、维生素等生物活性物质，同时含有种类丰富、数量巨大的微生物，具有生物肥料和生物农药的双重特性。将沼液作为有机肥施于农田或养殖水体，不仅能够提高农作物水产品的产量，改善土壤水体品质，而且可以减少化肥和农药的施用，提高能值产出率、资源利用效率。随着膜处理技术的发展，采用反渗透、纳滤膜等浓缩技术可实现了沼液浓缩。商品化浓缩沼液肥多使用复合软膜袋灌装以减少产品包装成本，但随着温度的升高，沼液肥中的微生物发酵过程加剧，沼液肥料软膜袋胀气现象严重甚至破袋，这不仅造成了巨大的经济损失，同时在产品存储、运输、销售中存在安全隐患。因此，如何解决沼液农用生物肥料软包装胀气是企业面临的严峻问题。发明内容本发明的首要目的在于提供一种消除沼液农用生物肥料软包装胀气并提高肥效的方法，旨在解决沼液农用生物肥料软装胀气问题的同时，还能有效提高该沼液农用生物肥料在提高土壤肥效、促进作物萌发率、提高幼苗质量、植物抗病害方面的效果。本发明是这样实现的，一种消除沼液农用生物肥料软包装胀气并提高肥效的方法，该方法为：将复合菌剂和CaO2添加到沼液农用生物肥料中，所述复合菌剂包括短小芽胞杆菌BacilluspumilusWP8、恶臭假单胞菌Pseudomonasputidasp.RBP1、不动杆菌Acinetobactersp.A6；其中，所述短小芽胞杆菌BacilluspumilusWP8，于2011年9月25日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏编号为CGMCCNo.5206；所述恶臭假单胞菌Pseudomonasputidasp.RBP1，于2011年8月31日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏编号为CGMCCNo.5205；所述不动杆菌Acinetobactersp.A6，于2015年7月2日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏编号为CGMCCNo.11033。优选地，所述沼液农用生物肥料中，CaO2的浓度为0.2～0.5gL，WP8菌浓度为106～109cfuL，RBP1菌浓度为105～108cfuL，A6菌浓度为105～108cfuL。优选地，所述复合菌剂主要由短小芽胞杆菌BacilluspumilusWP8悬液、恶臭假单胞菌Pseudomonasputidasp.RBP1悬液、不动杆菌Acinetobactersp.A6悬液混合后经离心去上清、加无菌水均匀后得到；其中，所述短小芽胞杆菌BacilluspumilusWP8悬液OD600为0.8～1.3、浓度为107～1011cfumL；所述恶臭假单胞菌Pseudomonasputidasp.RBP1悬液OD600为0.8～1.3、浓度为106～1010cfumL；所述不动杆菌Acinetobactersp.A6悬液OD600为0.6～1.2、浓度为105～109cfumL。优选地，所述离心为8000rpm下离心10min。优选地，所述沼液农用生物肥料中CaO2的浓度为0.2～0.5gL。本发明克服现有技术的不足，提供一种消除沼液农用生物肥料软包装胀气并提高肥效的方法。本发明通过化学试剂氧化钙与微生物菌剂联合使用，来解决沼液农用生物肥料软包装胀气问题，并同时有效提高该沼液农用生物肥料在提高土壤肥效、促进作物萌发率、提高幼苗质量、植物抗病害方面的效果。在本发明中，氧化钙CaO2一种兼具释氧性和氧化性的环境友好型材料，无臭、无毒，具有释氧和中和酸性土壤的性质，改善土壤理化性状和土壤养分状况，同时促进微生物活性，已广泛应用于土壤改良，水产增氧，污水处理，水果蔬菜保鲜等方面。此外，微生物菌剂由BacilluspumilusWP8、Pseudomonasputidasp.RBP1、Acinetobactersp.A6构成。其中，BacilluspumilusWP8是从根际土壤获得1株真正既广谱抗病，又高效促生的植物根际促生菌plantgrowthpromotingrhizobacteria，PGPR，并已在水稻育秧、豇豆、番茄、蚕豆等等植物上应用成功。BacilluspumilusWP8为短小芽胞杆菌，2011年8月31日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.5206。Pseudomonasputidasp.RBP1是从我国江苏省大丰麋鹿自然保护区芦苇根际土壤中分离、筛选出的植物根际促生菌plantgrowthpromotingrhizobacteria，PGPR，促进水稻秧苗素质，提高植株生防效应的假单胞菌属恶臭假单胞菌，2011年8月31日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.5205。Acinetobactersp.A6菌株是从我国江苏省盐城大丰水产养殖塘底泥中分离、筛选所得，对淡水养殖富营养化水体有净化功能，已于2015年7月2日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.11033。相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：1本发明有效消除了沼液农用生物肥料软包装所存在的高温胀气问题；2本发明可以提高沼液农用生物肥料施用后的土壤肥效，土壤微生物丰度与多样性；3本发明可以提高沼液农用生物肥料浸种后的种子萌发率；4本发明可以提高沼液农用生物肥料施用后经济作物的抗病害能力。附图说明图1是压差法实验装置简图；其中，1为U形压差计，2为放空夹，3为缓冲瓶，4为锥形瓶，5为恒温水浴锅；图2是不同配方对消除沼液农用生物肥料商品A软包装产气的效果；其中，柱状线显示三个重复的标准误差；ck：对照组；CaO2：添加一定浓度的CaO2；复合菌剂：BacilluspumilusWP8、Pseudomonasputidasp.RBP1、Acinetobactersp.A6；CaO2+复合菌剂：CaO2与复合菌剂混合；图3是不同配方对消除沼液农用生物肥料商品B软包装产气的效果；其中，柱状线显示三个重复的标准误差，ck:对照组，CaO2：添加一定浓度的CaO2，复合菌剂：BacilluspumilusWP8、Pseudomonasputidasp.RBP1、Acinetobactersp.A6；CaO2+复合菌剂：CaO2与复合菌剂混合；图4是施用不同配方的沼液肥的土壤16srRNA丰度；其中，柱状线显示三个重复的标准误差；ck：不施用肥料；A：商品化沼液农用生物肥料A；B：商品化沼液农用生物肥料B；沼液肥CaO2：添加CaO2的沼液农用生物肥料；复合菌剂：添加BacilluspumilusWP8、Pseudomonasputidasp.RBP1、Acinetobactersp.A6的沼液农用生物肥料；CaO2+复合菌剂：添加CaO2与复合菌剂的沼液农用生物肥料；图5是施用不同配方沼液肥对水稻种子萌发率的影响；其中，0为对照组，不添加沼液；10％、20％、40％、60％、80％稀释后不同浓度的沼液浓度添加了复合菌剂与CaO2；图中字母不同表示差异显著p﹤0.05；图6是施用不同配方沼液肥对番茄幼苗抗青枯病的影响；其中，Rs1115为添加沼液肥的病原菌实验对照组；沼液+复合菌剂为添加沼液肥含有复合菌剂后的病原菌实验组；沼液+CaO2为添加沼液肥含有CaO2后的病原菌实验组；沼液+复合菌剂+CaO2为添加沼液肥含有复合菌剂和CaO2后的病原菌实验组。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例菌株活化培养基LB培养基：950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，摇动容器直至溶质溶解，用1molLNaOH调pH至7.0用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。BacilluspumilusWP8菌株活化：将菌株转至LB固体平板上，30℃倒置培养18～24h后，挑取单菌落转至LB液体培养基，30℃，120～150rpm振荡培养18～24h后制备种子液。以1％的接种量转至LB液体培养基中，30℃振荡培养18～24h后，转至4℃环境静置30min后制备菌悬液。Pseudomonasputidasp.RBP1菌株活化：将菌株转至LB固体平板上，30℃倒置培养18～24h后，挑取单菌落转至LB液体培养基，30℃，120～150rpm振荡培养18～24h后制备种子液。以1％的接种量转至LB液体培养基中，30℃振荡培养18～24h后制备菌悬液。Acinetobactersp.A6菌株活化：将菌株转至LB固体平板上，25℃倒置培养18～24h后，挑取单菌落转至LB液体培养基，25℃，120～150rpm振荡培养18～24h后制备种子液。以1％的接种量转至LB液体培养基中，25℃振荡培养18～24h后制备菌悬液。菌悬液制备：取上述菌液转至离心管，8000rpm离心10min，弃上清液，加少量无菌水混匀，调整WP8菌悬液至OD600为0.8～1.3，调整RBP1菌悬液至OD600为0.8～1.3，调整A6菌悬液至OD600＝0.6～1.2后备用。复合菌剂的制备：无菌操作将上述WP8、RBP1与A6菌悬液以体积比为2：11比例混合，取混合菌悬液4mL，8000rpm离心10min，弃上清液，少量无菌水混匀后转至1mL无菌西林瓶，冷冻干燥24h后得复合菌剂。化学试剂与微生物菌剂体系投放方式：沼液农用生物肥料中添加CaO2，添加量为0.2～0.5gL；取适量水或沼液溶解上述复合菌剂，添加至1L沼液农用生物肥料中混合，得到农用生物肥料中WP8菌浓度为106～109cfuL，RBP1菌浓度为105～108cfuL，A6菌浓度为105～108cfuL。效果实施例一、实验过程将200mL沼液农用生物肥料添加至500mL三角瓶中，向其中添加0.4gL的CaO2混匀；添加WP8、RBP1、A6复合粉末，用少量无菌水溶解后添加至体系中，体系中菌起始浓度分别为109cfuL、108cfuL、107cfuL。体系混匀后，橡胶塞密闭瓶口并涂抹凡士林，依次连接缓冲瓶U型压力计该装置如图1。将三角瓶放置在35℃水浴锅中，记录各实验组产气压力。在沼液农用生物肥料商品沼液肥A、商品沼液肥B的样地中随机选取3个采样区，在每个采样区选择3个采样点。每个采样点分别采集10cm深度的土样3个，采集后土样立即装入无菌封袋中，车载冰箱带回实验室-4℃低温保存。除去石块、植物残体等过2mm筛，迅速提取土壤微生物DNA以做微生物分析。采用MoBIO公司的DNA快速提取试剂盒PowerSoil提取土壤微生物总DNA，步骤按操作说明进行。微生物基因组DNA的PCR扩增：细菌扩增引物采用引物对：正向F338：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'；反向R518：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。16srRNA扩增条件为首先是95℃预变性3min，40个循环为95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延1min，最后72℃延伸5min，保存在4℃冰箱中。每个样本重复3次。扩增后的PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测质量。变性梯度凝胶电泳DGGE：变性梯度凝胶的制备使用Bio-RAD公司475型梯度制胶系统Model475GradientDeliverySystem。变性梯度从上到下是35％～60％，聚丙烯酰胺凝胶浓度是8％。在90V的电压下，60℃电泳9h。电泳完毕后，将凝胶在固定液中固定3min，用银染液染色10min，然后用蒸馏水洗涤2次，再加显影液显影3min；将染色后的凝胶用Bio-RAD的GelDoc-2000凝胶影像分析系统拍照；用Imangelab分析软件Bio-RAD确定样品电泳条带的数量、亮度峰值，用SPSS13.0进行聚类分析。以去离子水稀释浓缩沼液，获得10％、20％、40％、60％和80％浓度梯度的沼液。在烧杯中加入各浓度梯度稀释后的浓缩沼液50mL，上述沼液中CaO2浓度为0.2gL，WP8菌浓度为108cfuL，RBP1菌浓度为106cfuL，A6菌浓度为106cfuL。每个烧杯中放入200颗种子，使种子完全浸入沼液中，每个处理重复3次。为防浸种过程中水稻种子缺氧，将烧杯置于恒温振荡器培养，温度为30℃，转速80r·min，浸种24h后，去离子水清洗种出去沼液后，将种子转移至光照培养箱。种子置于玻璃培养皿中，铺1层滤纸，用去离子水于每日早晚2次湿润滤纸，以无明显积水为准，每个培养皿放置20粒种子。催芽3d后记录水稻种子萌发率。将RalstoniasolanacearumRs1115菌种转接至TTC培养基检查其致病力后，挑取粉红色呈流动状态的菌落扩大培养备用。挑取有致病力的Rs1115接种至NB液体培养基，30℃，180r.min-1振荡培养24h后，转至无菌50mL离心管，5000r.min-1离心10min，弃上清液，细胞重悬于无菌水，混匀，使用前用无菌水调至所需浓度即可。添加复合菌剂、CaO2至浓缩沼液中，调整CaO2的浓度为0.2～0.5gL，WP8菌浓度为106～109cfuL，RBP1菌浓度为105～108cfuL，A6菌浓度为105～108cfuL。接种前，在番茄幼苗的一侧，用刀划3～5cm深沟，用50mL离心管定量取上述沼液，在断根侧灌注沼液，每株灌注沼液5～10mL左右，对照组等量无菌水代替。每隔3天追加1次上述沼液，共接种3次。以后每天浇水保持土壤湿润，不能忽干忽湿。RalstoniasolanacearumRs1115病原菌接种方法：接种沼液第12天后，将备用青枯菌Rs1115菌悬液用无菌水配制成3×106cfumL悬浊液。用同样的方法，在断根侧灌注菌液，100株灌注500mL每株灌注菌液5mL左右，对照组用等量无菌水代替。以后每天浇水保持土壤湿润，不能忽干忽湿。自发病之日起每天在同一时间观察记录生防效果组苗期番茄病株数，计算病情指数，分析沼液对番茄青枯病的生防效果。病级划分方法为：0级为叶面无症状，1级为植株上14以下的叶面表现萎蔫症状，2级为植株上14～12叶面表现萎蔫症状，3级为植株上12以上叶面表现萎蔫症状，4级为全株萎蔫死亡。病情指数计算方法：病情指数％＝∑各级病株数×各级代表值调查总株数×最高级代表值×100。生防效果计算方法：生防效果％＝沼液+Rs1115实验组病情指数—CK+Rs1115实验组病情指数CK+Rs1115实验组病情指数×100。二、实验结果结果如图2～4、表1所示：由图2中可以看出，添加不同组分的商品化沼液农用生物肥料A添加微生物菌剂在高温35℃环境下封闭体系中的压力变化。其中，随着时间推移，商品化沼液农用生物肥料A密闭体系压力达到2800Pa，在20h各处理均可降低沼液胀气现象；在23h后，与对照组相比较，添加CaO2与复合菌剂的实验组压力显著下降。由图3中可以看出，添加不同组分的商品化沼液农用生物肥B在高温35℃环境下封闭体系中压力变化。其中，高温下，商品化沼液农用生物肥料B在5h达到1500Pa，添加CaO2与复合菌剂的实验组仅为400Pa；21h后，添加不同配方的沼液商业肥B的压力大幅下降；25h后，对照组压力依然上升，各处理组的压力显著下降，添加CaO2与复合菌剂的实验组最终压力维持在-300Pa左右。由图4可以看出，施用不同配方的商品化沼液农用生物肥料A、B的土壤微生物丰度变化。与对照组相比，在施用商品化沼液农用生物肥料A、B后，16SrRNA丰度随着复合菌剂的添加上升，最高丰值出现在添加CaO2与复合菌剂的土壤中，为1.6×1011拷贝·g-1。此外，基于16SrRNA图谱的微生物多样性指数如下表1所示：表1基于16SrRNA图谱的微生物多样性指数表1中，ck为不施用肥料；A：商品化沼液农用生物肥料A；B：商品化沼液农用生物肥料B；沼液肥CaO2：添加CaO2的沼液农用生物肥料；复合菌剂：添加BacilluspumilusWP8、Pseudomonasputidasp.RBP1、Acinetobactersp.A6的沼液农用生物肥料；CaO2+复合菌剂：添加CaO2与复合菌剂的沼液农用生物肥料即本发明农用生物肥料。由表1中可以看出，添加复合菌剂、CaO2与复合菌剂的实验组中，丰度指数高，这表明，复合菌剂对于土壤微生物有积极影响；添加CaO2与复合菌剂实验组的Shannon指数最高，说明土样中细菌的多样性最高；样本的覆盖度指数Coverage都在99％以上，这说明所有样本的取样都非常合理，测序结果能够代表样本中细菌分布的真实情况，复合菌剂与CaO2联合使用可以提高土壤的肥效，提高土壤微生物丰度与多样性。以去离子水稀释浓缩沼液，获得10％、20％、40％、60％和80％浓度梯度的沼液。在烧杯中加入各浓度梯度稀释后的浓缩沼液50mL，每杯放入200颗种子，使种子完全浸入沼液中，每个处理重复3次。为防浸种过程中水稻种子缺氧，将烧杯置于恒温振荡器培养，温度为30℃，转速80r·min-1，浸种24h后，去离子水清洗种出去沼液后，将种子转移至光照培养箱。种子置于玻璃培养皿中，铺1层滤纸，用去离子水于每日早晚2次湿润滤纸，以无明显积水为准，每个培养皿放置20粒种子。催芽3d后记录水稻种子萌发率。由图5可以看出，随着沼液浓度的增加0～20％，水稻种子萌发率逐渐增加；当沼液浓度为20％时，实验组萌发率达到最高值81％，添加CaO2与复合菌剂的实验组萌发率为85％；随着沼液浓度的进一步增加40～100％，种子萌发率下降，100％浓缩沼液处理组的种子萌发率仅为9.8％。结果说明，20％以下浓度的沼液对种子萌发具有促进作用，浓度过高将抑制种子的萌发，最佳促进种子萌发的沼液浓度为20％。从图6可知，Rs1115组和沼液+CaO2组植株都在11d开始呈现青枯病病症，且沼液+CaO2组青枯病病情指数高于Rs1115组；12d之后，各处理组的病情指数均低于对照组Rs1115实验处理组；17d～21d，Rs1115组青枯病病情指数无明显上升，其余各实验组病情指数均为下降趋势；21d后病情指数开始下降，并在21d病情指数出现最大值77.5％。在整个实验过程中，添加了复合菌剂+CaO2的沼液对于青枯病的防治效果始终最佳。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种消除沼液农用生物肥料软包装胀气并提高肥效的方法，其特征在于，该方法为：将复合菌剂和CaO2添加到沼液农用生物肥料中，所述复合菌剂包括短小芽胞杆菌BacilluspumilusWP8、恶臭假单胞菌Pseudomonasputidasp.RBP1、不动杆菌Acinetobactersp.A6；其中，所述短小芽胞杆菌BacilluspumilusWP8，于2011年8月31日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏编号为CGMCCNo.5206；所述恶臭假单胞菌Pseudomonasputidasp.RBP1，于2011年8月31日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏编号为CGMCCNo.5205；所述不动杆菌Acinetobactersp.A6，于2015年7月2日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏编号为CGMCCNo.11033。2.如权利要求1所述的消除沼液农用生物肥料软包装胀气并提高肥效的方法，其特征在于，所述沼液农用生物肥料中，CaO2的浓度为0.2～0.5gL，WP8菌浓度为106～109cfuL，RBP1菌浓度为105～108cfuL，A6菌浓度为105～108cfuL。3.如权利要求1所述的消除沼液农用生物肥料软包装胀气并提高肥效的方法，其特征在于，所述复合菌剂主要由短小芽胞杆菌BacilluspumilusWP8悬液、恶臭假单胞菌Pseudomonasputidasp.RBP1悬液、不动杆菌Acinetobactersp.A6悬液混合后经离心去上清、加无菌水均匀后得到；其中，所述短小芽胞杆菌BacilluspumilusWP8悬液OD600为0.8～1.3、浓度为107～1011cfumL；所述恶臭假单胞菌Pseudomonasputidasp.RBP1悬液OD600为0.8～1.3、浓度为106～1010cfumL；所述不动杆菌Acinetobactersp.A6悬液OD600为0.6～1.2、浓度为105～109cfumL。4.如权利要求3所述的消除沼液农用生物肥料软包装胀气并提高肥效的方法，其特征在于，所述离心为8000rpm下离心10min。5.如权利要求1所述的消除沼液农用生物肥料软包装胀气并提高肥效的方法，其特征在于，所述沼液农用生物肥料中CaO2的浓度为0.2～0.5gL。

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