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申请/专利权人：四川大学

摘要：本发明的目的是提供一种基于镧系元素编码DNA四面体TDN的分析方法，以实现对新型冠状病毒SARS‑CoV‑2组分变体同时筛查的目的。本发明的原理是：构建一个由具有刚性分子支架和多顶点修饰特性的tTDN与多组分MNAzyme反应系统，tTDN‑MBs组装成卫星结构，通过MNAzyme对悬空探针的拼接可以实现159Tb、165Ho和169Tm镧系同位素标签释放出轨道。HV6970delα特异性、K417Nβ特异性和T478Kδ特异性变体，与包含这三种特征序列的变体Omicron可被同时检测。该方法的灵敏度为1.1‑1.5fmol，定量范围为5‑2000fmol。

主权项：1.一种基于镧系元素编码DNA四面体结构的新冠病毒多组分变体检测方法，其特征是按照以下操作步骤进行：a.制备元素标签镧系大环化合物MMA-DOTA-Tb3+Ho3+Tm3:a1为了制备元素标签镧系大环化合物MMA-DOTA-Tb3+Ho3+Tm3，首先将MMA-DOTA和镧系金属盐分别溶于0.5MNH4AC缓冲液中pH5.8，形成10mM和5mM的储备溶液；a2将10μL的10mM镧系元素和10μL的5mMMMA-DOTA混合，在37℃下轻轻摇动培养1小时；a3反应结束后，所制备的镧系复合物通过电喷雾电离质谱法ESI-MS进行表征；b.制备元素标签镧系大环化合物MMA-DOTA-Tb3+Ho3+Tm3标记的MNAzyme底物:b1将3′端巯基化的ssDNA溶解在0.5MNH4AC缓冲液pH5.8中，浓度为100μM；b2然后，将60μL的ssDNA与10mMTCEP在37℃下孵育10分钟，并使用超滤管进行纯化；然后，将制备元素标签镧系大环化合物MMA-DOTA-Tb3+Ho3+Tm3加入反应液中，在37℃下孵育2小时；c.制备三价DNA四面体tTDNc1三个同位素标记的DNA轨道，以及一个生物素标记的DNAt-T作为tTDN结构的第四条骨架，分别稀释到8μM，在最终浓度为2μM时，将等摩尔量的组成DNA链在TM缓冲液中混合；混合的链被加热到90℃保持5分钟，然后迅速冷却到4℃并保持至少15分钟；d.构建三价DNA四面体tTDN-磁珠MBs卫星d1对链霉亲和素修饰的磁性微球SA-MBs进行RNA酶RNase灭活处理：对于100μL的10mgmL-1SA-MB，用溶液A洗涤两次溶液A:100mmolL-1NaOH，50mmolL-1NaCl，用溶液B溶液B:100mmolL-1NaCl洗涤一次，然后用BW缓冲液BW缓冲液，10mmolL-1Tris-HCland1mmolL-1EDTA，2molL-1NaCl冲洗，然后再分散在100μL的BW缓冲液中；d2100μL的SA-MBs在使用前用TM缓冲液预洗，然后与500μL制备的2MtTDN混合，三重探针tTDN-MBs是在室温下轻轻摇晃培养一小时后形成，通过SA和tTDN上的生物素之间的特殊结合将tTDN固定在MBs表面；d3用TMR缓冲液将tTDN-MBs清洗三次，在用TM缓冲液冲洗以去除多余的未反应的DNA后再使用；e.基于tTDN-MNAzyme纳米系统的HV6970del,K417N,T478K的多重检测:e1每个MNAzyme的partzymeA和partzymeBDNA事先在TMR缓冲液中溶解到1μM，并取5μL，与10μL制备的tTDN-MBs混合；e2将不同浓度的分析物样品的加入量统一为10μL，最后用TMR将整个tTDN-MNAzyme纳米系统的体积补充至100μL；e3在37℃的温度下，轻轻摇晃3小时，使其充分反应，使同位素探针完全剪切；f.ICPMS测定:f1磁力分离后，上清液中反应物和产物的总体积为每管100μL；用1％的HNO3稀释至最终体积为1mL，用ICPMS以TbHoTm同位素同时检测模式进行测量。

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百度查询： 四川大学 一种基于镧系元素编码DNA四面体结构的新冠病毒多组分变体检测方法