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申请/专利权人：云南农业大学

摘要：本发明涉及一种十基因编辑异种器官移植供体猪的构建方法，属动物生物技术领域。在野生型猪胎儿成纤维细胞系中，敲除GGTA1、β4GalNT2、CMAH基因，转入hCD39、hCD46、hCD47、hCD55、hCD59、hTBM、hEPCR人源化基因，构建GTKOβ4GalNT2KOCMAHKOhCD39hCD46hCD47hCD55hCD59hTBMhEPCR十基因编辑克隆猪，进一步对克隆猪基因型鉴定、mRNA和蛋白表达分析，获得十基因编辑异种器官移植供体猪。本发明通过对猪抗原基因敲除并转入人源化基因进行组合修饰，解决了异种器官移植过程中面临的超急性免疫排斥反应、抗原‑抗体介导的免疫排斥反应、受体免疫细胞活化及凝血障碍等问题，克服了现有克隆猪生产率低、存活率低及基因编辑成功率低等障碍，对促进猪‑非人灵长类异种器官移植临床前研究和猪‑人异种器官移植临床化应用具有重要的应用价值。

主权项：1.GTKOβ4GalNT2KOCMAHKOhCD39hCD46hCD47hCD55hCD59hTBMhEPCR十基因编辑猪胎儿成纤维细胞系，其特征在于：所述十基因编辑猪胎儿成纤维细胞系的制备方法如下：1）将GGTA1、β4GalNT2、CMAH基因sgRNA打靶载体或用于敲除猪基因组中的GGTA1、β4GalNT2、CMAH基因的重组质粒，和，hCD39、hCD46、hCD55、hCD59、hTBM人源化基因转入表达载体在转座酶的作用下共同转染至野生型猪胎儿成纤维细胞中，经筛选获得的八基因编辑阳性单克隆细胞系，即为GTKOβ4GalNT2KOCMAHKOhCD39hCD46hCD55hCD59hTBM八基因编辑猪成纤维细胞系，并以此为供体细胞进行体细胞核移植，构建GTKOβ4GalNT2KOCMAHKOhCD39hCD46hCD55hCD59hTBM八基因编辑猪胎儿成纤维细胞系；所述GGTA1、β4GalNT2、CMAH基因sgRNA打靶载体为利用CRISPRCas9基因编辑技术，构建GGTA1、β4GalNT2、CMAH基因sgRNA打靶载体，sgRNA作用位点位于猪GGTA1基因的第3外显子、β4GalNT2基因的第2外显子、CMAH基因的第4外显子；所述用于敲除猪基因组中的GGTA1、β4GalNT2、CMAH基因的重组质粒的核苷酸序列如SEQIDNO:10所示；所述hCD39、hCD46、hCD55、hCD59、hTBM人源化基因转入表达载体，是基于piggyBac转座子系统，构建hCD39、hCD46、hCD55、hCD59、hTBM人源化基因转入表达载体，其核苷酸序列如SEQIDNO:18所示；2）将GGTA1基因sgRNA打靶载体或用于敲除基因组中的GGTA1基因的重组质粒，和，hCD47、hEPCR人源化基因转入表达载体在转座酶的作用下共同转染至GTKOβ4GalNT2KOCMAHKOhCD39hCD46hCD55hCD59hTBM八基因编辑猪胎儿成纤维细胞系中，经筛选获得十基因编辑阳性单克隆细胞系，即为GTKOβ4GalNT2KOCMAHKOhCD39hCD46hCD47hCD55hCD59hTBMhEPCR十基因编辑猪胎儿成纤维细胞系；所述GGTA1基因sgRNA打靶载体，sgRNA作用位点位于猪GGTA1基因的第8外显子，sgRNA打靶载体包括：GGTA1-sgRNA3和GGTA1-sgRNA4；GGTA1-sgRNA3的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；GGTA1-sgRNA4的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，分别连接至骨架载体PX458-sgRNA-EGFP，骨架载体的基因序号为：Addgeneno：112220；所述用于敲除基因组中的GGTA1基因的重组质粒的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示；所述hCD47、hEPCR人源化基因转入表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO:20所示。

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