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摘要：一种基于RPA‑CRISPR‑Cas12a结合数字微流控平台的幽门螺杆菌快速检测试剂及方法，其包括用于检测CagA基因的引物对、用于检测VacA基因的引物对和用于检测ureB基因的引物对、针对检测幽门螺杆菌cagA基因、vacA基因和ureB基因的特异性crRNA、用于幽门螺杆菌快速检测及毒力分型的方法的ssDNA荧光报告子。其目的在于提供一种利用数字微流控平台同时对幽门螺杆菌的三种目标核酸分子进行高灵敏、高特异的快速多重检测，该多重检测可有效避免气溶胶污染，非常适合在医院及医院外的各种场合进行的基于RPA‑CRISPR‑Cas12a结合数字微流控平台的幽门螺杆菌快速检测试剂及方法。

主权项：1.幽门螺杆菌快速检测试剂，其特征在于：包括用于检测CagA基因的引物对、用于检测VacA基因的引物对和用于检测ureB基因的引物对、针对检测幽门螺杆菌cagA基因、vacA基因和ureB基因的特异性crRNA、用于幽门螺杆菌快速检测及毒力分型的方法的ssDNA荧光报告子、用于检测cagA基因的重组酶聚合酶扩增RPA反应试剂、用于检测vacA基因的重组酶聚合酶扩增RPA反应试剂、用于检测ureB基因的重组酶聚合酶扩增RPA反应试剂、用于检测cagA基因的CRISPR-Cas12a反应试剂、用于检测vacA基因的CRISPR-Cas12a反应试剂、用于检测ureB基因的CRISPR-Cas12a反应试剂和数字微流控平台；所述用于检测CagA基因的引物对分别为cagA上游引物和cagA下游引物；所述cagA上游引物为TAACAACCCTAGTTTTTATCTCTACAAAGAAG，所述cagA下游引物为GCTTAGAGTCTTTTTGAAAATCCTTAATCTCA；所述用于检测VacA基因的引物对分别为VacA上游引物和VacA下游引物；所述VacA上游引物为CTTTTAGTGGAAAATCTAACCGGGAATATCAC，所述VacA下游引物为AAATCTTCCCAGACTAATATCGTTATTGAAAG；所述用于检测ureB基因的的引物对分别为ureB上游引物和ureB下游引物；所述ureB上游引物为GCTGAAGAATATTCTATGAACTTAGGTTTCTT，所述ureB下游引物为CTTGCACATCGTATTTGTCTGCAACATCTAAC；所述用于检测cagA基因的特异性的cagA-crRNA，即cagA-crRNA为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGATCTCTTCTTGACTCAAT或UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUTGCAAGAAATTCCATGAAAT；所述用于检测vacA基因的特异性的vacA-crRNA，即vacA-crRNA为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCAGGATCAAGCGCGAATTT或UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGTATCCACACCAGCCTTAAA；所述用于检测ureB基因的特异性的ureB-crRNA，即ureB-crRNA为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUATCCGCTAAGCTCGCGTCGT或UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAGCCAATCGCACCGGCTTC；所述用于幽门螺杆菌快速检测及毒力分型的方法的ssDNA荧光报告子的结构为FAM-8N-TAMRA，具体为5′-FAM-TTATTATT-TAMRA-3′；所述用于检测cagA基因的RPA反应试剂包括：37μL的RPA反应缓冲液，1.5μL的脱氧核糖核苷三磷酸混合夜，脱氧核糖核苷三磷酸混合夜的初始浓度为10mM，2μL的cagA上游引物，cagA上游引物的初始浓度为10μM，2μL的cagA下游引物，cagA下游引物的初始浓度为10μM，2μL的样本DNA，3μL的DEPC处理水，2.5μL的醋酸镁，醋酸镁的初始浓度为280mM；所述用于检测vacA基因的RPA反应试剂包括：37μL的RPA反应缓冲液，1.5μL的脱氧核糖核苷三磷酸混合夜，脱氧核糖核苷三磷酸的初始浓度为10mM，2μL的vacA上游引物，vacA上游引物的初始浓度为10μM，2μL的vacA下游引物，vacA下游引物的初始浓度为10μM，2μL的样本DNA，3μL的DEPC处理水，2.5μL的醋酸镁，醋酸镁的初始浓度为280mM；所述用于检测ureB基因的RPA反应试剂包括：37μL的RPA反应缓冲液，1.5μL的脱氧核糖核苷三磷酸混合夜，脱氧核糖核苷三磷酸初始浓度为10mM，2μL的ureB上游引物，ureB上游引物的初始浓度为10μM，2μL的ureB下游引物，ureB下游引物的初始浓度为10μM，2μL的样本DNA，3μL的DEPC处理水，2.5μL的醋酸镁溶液，醋酸镁初始浓度为280mM；所述用于检测cagA基因的CRISPR-Cas12a反应试剂包括2μL的RPA扩增产物，1.25μL的cagA-crRNA，cagA-crRNA的起始浓度为1μM，2μL的NEBufferr2.1，1μL的LbCas12a蛋白，LbCas12a蛋白的起始浓度为1μM，1μL的ssDNA荧光报告子，ssDNA荧光报告子的起始浓度为10mM，12.75μL的DEPC水；所述用于检测vacA基因的CRISPR-Cas12a反应试剂包括2μL的RPA扩增产物，1.25μL的vacA-crRNA，vacA-crRNA的起始浓度为1μM，2μL的NEBufferr2.1，1μL的LbCas12a蛋白，LbCas12a蛋白的起始浓度为1μM，1μL的ssDNA荧光报告子，ssDNA荧光报告子的起始浓度为10mM，12.75μL的DEPC水；所述用于检测ureB基因的CRISPR-Cas12a反应试剂包括2μL的RPA扩增产物，1.25μL的ureB-crRNA，ureB-crRNA起始浓度为1μM，2μL的NEBufferr2.1，1μL的LbCas12a蛋白，LbCas12a蛋白的起始浓度为1μM，1μL的ssDNA荧光报告子，ssDNA荧光报告子的起始浓度为10mM，12.75μL的DEPC水；所述数字微流控平台上的右侧设有样本加载区1、cagA—RPA试剂区2、vacA—RPA试剂区3和ureB—RPA试剂区4；cagA—RPA试剂区2内预先存放有用于检测cagA基因的重组酶聚合酶扩增RPA反应试剂，vacA—RPA试剂区3内预先存放有用于检测vacA基因的重组酶聚合酶扩增RPA反应试剂，ureB—RPA试剂区4内预先存放有用于检测ureB基因的重组酶聚合酶扩增RPA反应试剂；所述数字微流控平台上的左侧设有阴性对照加载区5、cagA—CRISPR试剂区6、vacA—CRISPR试剂区7和ureB—CRISPR试剂区8；cagA—CRISPR试剂区6内预先存放有用于检测cagA基因的CRISPR-Cas12a反应试剂，vacA—CRISPR试剂区7内预先存放有用于检测vacA基因的CRISPR-Cas12a反应试剂，ureB—CRISPR试剂区8内预先存放有用于检测ureB基因的CRISPR-Cas12a反应试剂。

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