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龙图腾网恭喜广州医科大学附属第一医院(广州呼吸中心)申请的专利蛇毒致急性肺损伤小鼠肺部免疫细胞图谱特征的建立方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN115032374B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-05-27发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202111420777.X，技术领域涉及：G01N33/50；该发明授权蛇毒致急性肺损伤小鼠肺部免疫细胞图谱特征的建立方法是由黄君庭;梁子敬;周红甜;张志文设计研发完成，并于2021-11-26向国家知识产权局提交的专利申请。

本蛇毒致急性肺损伤小鼠肺部免疫细胞图谱特征的建立方法在说明书摘要公布了：本发明提供了蛇毒致急性肺损伤小鼠肺部免疫细胞图谱特征的建立方法，包括以下步骤：S1提取免疫细胞；S2偶联；S3染色；S4生信分析；本发明的有益效果：肺部组织均匀剪碎进行解离，根据细胞密度进行离心，分离得到大量的免疫细胞，采用高糖培养基进行洗涤，最大程度保证了肺部免疫细胞的得率和活性；通过台盼蓝染色可得知所得细胞的活率，基本大于90％；能够对小鼠肺部免疫细胞同时进行42个抗体检测，对细胞特异性标志和功能蛋白进行检测，能观察到肺部细胞亚群的动态变化。

本发明授权蛇毒致急性肺损伤小鼠肺部免疫细胞图谱特征的建立方法在权利要求书中公布了：1.蛇毒致急性肺损伤小鼠肺部免疫细胞图谱特征的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：S1提取免疫细胞取因腹腔注射圆斑蝰蛇蛇毒所致急性肺损伤的小鼠，6h处死，心脏灌注，灌流出肺组织内部血液后摘取肺脏；将肺脏剪碎后与解离液混匀，在水浴箱中消化30min，再进行密度梯度离心和红细胞裂解，得到纯净的小鼠肺部免疫细胞；S2偶联使用抗体偶联试剂盒，将金属同位素与小鼠肺部免疫细胞标志物抗体连接，得到金属标记的抗体；S3染色将分离得到的小鼠肺部免疫细胞与金属标记的抗体进行孵育，标记免疫细胞；S4生信分析将标记后的小鼠肺部免疫细胞在质谱流式上机分析，采用t-SNE和phenograph算法对所得数据进行降维和聚类；然后将不同细胞亚群的多个检测抗体的表达分布显示在同一张热图上，并通过t-SNE图展现不同标志物的表达在不同细胞亚群的表达量以及细胞亚群在细胞总数所占的比例，以此表现小鼠肺部免疫细胞的分类和功能观察；所述金属同位素采用cd金属同位素，所述抗体偶联试剂盒采用MaxparMCP9试剂盒，所述S2包括以下步骤：2.1取管子加入87ul、L-Buffer重悬polymer，并加入13ul、50mM、Cd元素溶液，37℃水浴60min，将其转移至装有100ul、L-Buffer的3kD柱子中，再向polymer管加入100ul、L-Buffer清洗管壁，然后转移至3kDa滤柱中，充分混匀，室温以相对离心力12000g离心处理25分钟，弃上清，加入300ul、L-Buffer，室温以相对离心力12000g离心处理30分钟，加入400ul、C-Buffer，常温以相对离心力12000g离心处理45分钟；2.2取50kDa柱子加入100ug抗体，用R-Buffer将体积补足至400ul，室温以相对离心力12000g离心处理10分钟，弃废液，加入400ul、R-Buffer，室温以相对离心力12000g离心处理10分钟，重复本操作一次；2.3用R-buffer稀释TCEP至终浓度4mM，取100ul加入含有抗体的50kDa柱子，37℃水浴30min；2.4往3kD柱子中加入400ul、C-Buffer，室温以相对离心力12000g离心处理30分钟；2.5水浴结束后取50kDa柱子，往滤柱中加入300ul、C-Buffer，室温以相对离心力12000g离心处理10分钟，弃废液，重复本操作一次；2.6用60ul、C-Buffer重悬3kDa滤芯中金属和polymer的连接体，体转移至装有还原抗体的50kDa滤芯中，总体积约100ul，轻柔吹打混匀，37℃水浴90min；2.7水浴结束后，取出50kDa滤柱，向滤芯中加入200ul、W-Buffer，混匀，转移至新标记的100kDa滤芯中，常温以相对离心力5000g离心处理10分钟；2.8加入400ul、W-Buffer，室温以相对离心力5000g离心处理10分钟，弃废液，重复本操作三次；2.9向滤芯中加入75ul、W-Buffer，取2ul液体，在280nm下测定其光密度值，计算抗体浓度；2.10室温以相对离心力12000g离心处理5分钟，加入的抗体稳定液的体积，即获得金属标记好的抗体；或，所述金属同位素采用镧系金属，所述抗体偶联试剂盒采用MaxparX8试剂盒，所述S2包括以下步骤：2.1取管子加入95ul、L-Buffer重悬polymer，并加入5ul、50mM的镧系金属溶液混匀，37℃水浴30min，将其转移至装有200ul、L-Buffer的3kD柱子中，充分混匀，室温以相对离心力12000g离心处理25分钟，弃上清，重复本操作一次；2.2取50kDa柱子加入100ug抗体，用R-Buffer将体积补足至400ul，室温以相对离心力12000g离心处理10分钟；2.3用R-Buffer稀释TCEP至终浓度4mM，取100ul加入含有抗体的50kDa柱子，37℃水浴30min；2.4往3kD柱子中加入400ul、C-Buffer，室温以相对离心力12000g离心处理30分钟；2.5水浴结束后取50kDa柱子，往滤柱中加入300ul、C-Buffer，室温以相对离心力12000g离心处理10分钟，弃废液，重复本操作一次；2.6用60ul、C-Buffer重悬3kDa滤芯中金属和polymer的连接体，体转移至装有还原抗体的50kDa滤芯中，总体积约100ul，轻柔吹打混匀，37℃水浴90min；2.7水浴结束后，取出50kDa滤柱，向滤芯中加入200ul、W-Buffer，室温以相对离心力12000g离心处理10分钟；2.8加入400ul、W-Buffer，室温以相对离心力12000g离心处理10分钟，弃废液，重复本操作三次；2.9向滤芯中加入80ul、W-Buffer，取2ul液体，在280nm下测定其吸光值，计算抗体浓度；2.10室温以相对离心力12000g离心处理10分钟，加入的抗体稳定液的体积，即获得金属标记好的抗体。

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