买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：扬州大学

摘要：本发明涉及一种GyV5新型环形病毒VP3蛋白的制备方法。该方法以pGEX‑6p‑1质粒以及GyV5病毒VP3基因为模板，PCR分别扩增出含pGEX‑6p‑1线性化载体以及GyV5病毒VP3基因片段，并利用重组酶ExnaseTM II进行快速重组克隆；阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。本发明可直接提供VP3蛋白作为GyV5诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体；为开展GyV5血清学流行病学调查及VP3功能研究提供有效免疫学试剂，填补国内外空白。

主权项：一种GyV5新型环形病毒VP3蛋白的制备方法，其特征在于，以pGEX‑6p‑1质粒以及GyV5病毒VP3基因为模板，PCR分别扩增出含pGEX‑6p‑1线性化载体以及GyV5病毒VP3基因片段，并利用重组酶ExnaseTM II进行快速重组克隆；阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。

全文数据：一种GyV5新型环形病毒VP3蛋白制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种GyV5新型环形病毒VP3蛋白的制备方法。此发明可直接提供VP3蛋白作为GyV5诊断抗原;作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体;为开展GyV5血清学流行病学调查及VP3功能研究提供有效免疫学试剂，填补国内外空白。背景技术[0002]鸡传染性贫血病毒ChickenInfectiousAnemiaVirus，CAV-直被认为是圆环病毒科Circoviridae中环形病毒属Gyrovirus唯一成员。直到2011年，Rijsewijk等从发病鸡的血清样品中检测到新型环形病毒序列，即环形病毒属中第二个成员，命名为AGV2。同年，Sauvage等在健康人的皮肤棉试样品中检测到首个与AGV2高度同源的人源环形病毒HGyV序列。自2012年，其它新型环形病毒包括GyV3，GyV4，GyV5，GyV6，GyV7，GyV8及GyV9被陆续发现鉴定，并具有潜在的公共卫生意义。然目前尚无检测GyV5抗原及其抗体的血清学方法。因此，对GyV5病毒早期表达蛋白VP3基因在体外进行克隆，构建VP3表达载体，实现其表达，将为深入开展GyV5蛋白抗原及其抗体检测、血清学调查，明确GyV5在鸡群以及人群中的感染复制情况提供有效诊断试剂;并为探究GyV5VP3生物学功能具有重要意义。在传统表达载体的构建中，往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法构建载体，实现外源基因的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁琐，效率低下。本发明中将利用不依赖于酶切位点及限制性内切酶的重组酶ExnaseTMII体外重组技术克隆GyV5病毒VP3基因，简化克隆过程，实现VP3基因快速克隆表达。发明内容[0003]本发明的目的是提供一种GyV5新型环形病毒VP3蛋白制备方法，实现VP3蛋白的表达。[0004]本发明的原理和最核心的关键技术是科学地设计扩增出pGEX-6p-l线性化载体以及GyV5病毒VP3基因片段的引物，利用商品化的重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3,转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现GyV5的VP3蛋白与GST的融合表达，并获得纯化的VP3融合蛋白。[0005]本发明所述的GyV5新型环形病毒VP3蛋白的制备方法，以pGEX-6p_l质粒以及GyV5病毒VP3基因为模板，PCR分别扩增出含pGEX-6p-l线性化载体以及GyV5病毒VP3基因片段附图1，步骤1，并利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆（附图1，步骤2;阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达附图1，步骤3。[0006]上述方法包括以下步骤：[0007]1利用下述引物，以PGEX-6P-1质粒为模板，PCR扩增出PGEX-6P-1线性化表达载体；[0010]2利用下述引物，以GyV5-VP3基因为模板，PCR扩增出VP3基因；[0013]3利用重组酶ExnaseTMII对步骤1和2得到的PCR产物进行快速重组克隆；阳性克隆经IPTG诱导后进行表达鉴定与纯化。[0014]本发明公开了PCR扩增PGEX-6P-1线性化载体引物以及PCR扩增GyV5病毒VP3基因引物序列。本发明还公开了一种基于重组酶ExnaseTMII将线性化的pGEX-6p-l线性化载体与GyV5病毒VP3基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆技术并转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。[0015]本发明设计的引物及基于重组酶ExnaseTMII的克隆策略，可快速构建GyV5病毒VP3基因的原核表达载体。本发明获得的GyV5病毒VP3表达及纯化的蛋白，可直接提供VP3蛋白作为GyV5诊断抗原;作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体;为开展GyV5流行病学调查提供有效诊断试剂;并为进一步探究VP3生物学功能具有重要意义。附图说明[0016]图1一种GyV5新型环形病毒VP3蛋白制备方法策略示意图[0017]步骤1:以人工合成的GyV5病毒VP3基因为模板，利用引物，PCR分别扩增出含pGEX-6p-l线性化载体以及GyV5病毒VP3基因片段。[0018]步骤2:利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆。[0019]步骤3:阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。[0020]图2PCR扩增GyV5病毒VP3片段[0021]泳道l，GyV5病毒VP3片段PCR产物;泳道M，DNAMarker。[0022]图3PCR扩增线性化载体pGEX-6p-l[0023]泳道1，线性化载体pGEX-6p-l的PCR产物;泳道M，DNAMarker。[0024]图4SDS-PAGE分析GyV5病毒VP3基因的表达[0025]泳道1、2代表1PTG诱导的VP3超声裂解样品上清和沉淀；泳道3、4是纯化的VP3蛋白；泳道5、6是GST超声裂解样品上清和沉淀。[0026]图5Westernblot鉴定抗AGV5VP3蛋白多克隆抗体[0027]1，转染EGFP-VP3表达质粒的293T细胞裂解物；2，为转染对照EGFP表达质粒的293T细胞裂解物。具体实施方式[0028]为更好的理解本发明的内容，以下实施方式结合附图给出了GyV5新型环形病毒VP3蛋白制备的不例。[0029]实施例[0030]1设计扩增含PGEX-6P-1线性化载体以及GyV5病毒VP3基因片段引物:扩增pGEX-6p_l线性化载体上游引物位于pGEX-6p-l质粒1022-1047位;且在5'端带有额外TAA碱基;扩增pGEX-6p-l线性化载体下游引物位于pGEX-6p-l质粒916-941位;且在5'端带有额外CAT碱基。扩增GyV5病毒VP3基因上游引物包括VP3基因起始密码ATG及其后14个碱基，且在5'端带有16个与pGEX-6p-l线性化载体下游引物反向互补碱基;扩增GyV5病毒VP3基因下游引物包括VP3基因终止密码TAA及其前14个碱基，且在5'端带有16个与pGEX-6p-l线性化载体上游引物反向互补碱基。具体引物序列如下，由LifeTechnologies上海赛默飞世尔科技公司合成。[0031]pGEX-6p-l线性化表达载体引物：[0034]GyV5_VP3基因引物：[0037]2pGEX-6p-l线性化载体以及GyV5病毒VP3基因片段PCR扩增：以pGEX-6p-l质粒以及合成的GyV5VP3基因（GenBank:KF294861.1为模版，上述1中引物为引物进行PCR扩增。如图1中的步骤UPCR扩增反应体系为:40μ1水，5μ110倍缓冲液，ΙμL10mMdNTP，lyl10μmol上游引物，ΙμLΙΟμmol下游引物，ΙμLlOngμΙ的pGEX-6p-l质粒或pcGyV5-VP3质粒，ΙμL商品化的PhantaSuper-FidelityDNA聚合酶。PCR扩增反应循环参数为:94°C变性5分钟，随后进行30个循环94°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸3分钟），最后72°C延伸10分钟。PCR结束后，PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳。如图2所示，其中泳道Μ为DNAMarker，其中泳道1为GyV5病毒VP3片段PCR产物。如图3所示，其中泳道Μ为DNAMarker，泳道1为线性化载体pGEX-6p-l的PCR产物。[0038]3GyV5病毒VP3片段快速克隆pGEX-6p-l载体：将以上纯化的表达线性化载体pGEX-6p-l以及GyV5病毒VP3片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTMII的作用下进行重组克隆。如图1中的步骤2。具体重组反应体系如下:纯化的GyV5病毒VP3片段产物50-100ng，纯化的pGEX-6p-l表达线性化载体50ng，2μ1商品化的ExnaseTMII酶，4μ15倍的缓冲液，其它补加水至20μ1。反应物于37°C作用30分钟后，置冰上5分钟。随后将20μ1反应物转化到常规感受态细菌，涂LB板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备，阳性克隆鉴定。[0039]4GyV5病毒VP3蛋白诱导表达及其纯化:将获得的含GyV5病毒VP3基因的阳性克隆命名为PGEX-VP3转化BL21细菌，经IPTG诱导（0.lmmolml后收集细菌，进行超声（40赫兹）破碎。将超声破碎样品离心后分上清与沉淀进行SDS-PAGE5%的浓缩胶，10%的分离胶）以及Westernblot分析（以抗鼠源的GST单抗为一抗，羊抗鼠HRP标记的IgG为二抗鉴定表达。在图4中，VP3蛋白可在超声破碎样品上清中以可溶性形式存在。在确定VP3的可溶性表达基础上，将超声破碎样品上清通过GST纯化柱进行了VP3蛋白的纯化。图4中泳道1、2代表1PTG诱导的VP3纯化前超声裂解样品上清和沉淀，泳道3、4是VP3蛋白纯化后SDS-PAGE分析结果，泳道5、6是GST超声裂解样品上清和沉淀。为进一步测定纯化后蛋白的抗原性，评价其能否作为免疫原及诊断用抗原，将纯化的VP3蛋白免疫小鼠，并通过westernblot分析证明了获得的抗GyV5病毒VP3蛋白的小鼠多抗能与在293T细胞中表达的VP3蛋白进行特异性反应（图5。这一结果表明本发明表达的VP3蛋白具有很好的反应性及免疫原性，在GyV5血清学诊断中将具有良好的应用前景。

权利要求：1.一种GyV5新型环形病毒VP3蛋白的制备方法，其特征在于，以pGEX-6p-1质粒以及GyV5病毒VP3基因为模板，PCR分别扩增出含pGEX-6p-l线性化载体以及GyV5病毒VP3基因片段，并利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆；阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤：1利用下述引物，以pGEX-6p-l质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-l线性化表达载体；上游引物:5'TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC3'；下游引物:5'CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT3'；2利用下述引物，以GyV5-VP3基因为模板，PCR扩增出VP3基因；上游引物：5'GITCCAGGGGCCCATGITGGCTGACGAGIT3'；下游引物：5'GITITCACCGTCATTAAAGTTCTTCTTGTA3'；3利用重组酶ExnaseTMII对步骤1和2得到的PCR产物进行快速重组克隆；阳性克隆经IPTG诱导后进行表达鉴定与纯化。

百度查询： 扬州大学 一种GyV5新型环形病毒VP3蛋白制备方法