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摘要：本发明公开了一种基于少量细胞全基因组染色质高分辨率构象技术eHi‑C 2.0.本发明提供了一种细胞eHi‑C 2.0测序文库的制备方法为：裂解细胞得到染色质，再酶切所述染色质；将所述酶切后DNA依次经标记物标记和钝端连接，得到环化产物；向所述环化产物中引入内参环状共沉淀DNA分子；再用限制性外切酶酶切，再进行超声打断，再用免疫磁珠从打断产物中抓取带有所述标记物的DNA片段；用所述带有所述标记物的DNA片段制备eHi‑C 2.0测序文库。本发明能对数量低至0.1million细胞的进行全基因组染色质构象技术eHi‑C建库测序。

主权项：一种细胞eHi‑C 2.0测序文库的制备方法，包括如下步骤：1裂解细胞得到染色质，再酶切所述染色质，得到酶切后DNA；所述酶切所用的限制性内切酶为HpyCH4IV和MboI；2将所述酶切后DNA依次经标记物标记和钝端连接，得到环化产物；3向所述环化产物中引入内参环状共沉淀DNA分子，得到混合物；再用限制性外切酶酶切所述混合物，得到去除线性DNA分子的混合物；所述限制性外切酶为Lambda和Exonuclease I；4将所述去除线性DNA分子的混合物进行超声打断，再用免疫磁珠从打断产物中抓取带有所述标记物的DNA片段；5用所述带有所述标记物的DNA片段制备eHi‑C 2.0测序文库。

全文数据：一种基于少量细胞全基因组染色质高分辨率构象技术eHi-C2.0技术领域[0001]本发明涉及基因组测序技术领域，具体涉及一种基于少量细胞的全基因组染色质构象技术eHi-C2.0。背景技术[0002]三维基因组学是以研究全基因组染色质）三维空间结构及其功能为对象的一门新兴学科[RuanY，2011，SCienCe];其研究范围涵盖了基因组的三维空间结构可视化解析及模拟，全基因组互作网络研究、染色质动态结构域、三维数据挖掘，三维结构与信号通路功能解析、关键基因或因子挖掘等重要研究内容[SchmittA.D，RenB，2016，NatureReviewsMolecularCellBiology]。近年来，以染色质构象捕捉技术（Chromosomeconformationcapture为基础的三维基因组学技术得到了长足的发展，可以获取从单基因位点（3C到全基因组范围内（Hi-C的三维基因互助及结构图谱的相关信息[DekkerJ，2002，ScienCe]，并且，这些结果通过与不同类型的生物学数据进行系统整合，可以实现基因组三维空间结构到生物体或细胞生物学特性的研究过程的融合，为系统研究三维基因组结构和生物表型数据间的联系提供了理论基础和可能，也是当前基因组学研究的热点之一[SmallwoodA,RenB,2013,CurrentOpinioninCellBiology]。[0003]当前，有关三维基因组学技术研究的进展很快，一系列以高通量测序为基础的技术已经被开发应用于这方面的研究工作，包括3C，4C，5C，Hi-C，in-situHi-C，Capture-C，3C_Seq，ChIP-Seq，ChIP-Loop，HiChIP，ATAC-See，Micro_CXL，ChIA-PET等；这些技术的研发及应用已经成为3D基因组研究的重要内容。在这些技术中，应用于全基因组水平上的三维基因组学技术研究成为目前的研究重点，由JobDekker研发的Hi-CHigh-throughputchromosomeconformationcapture[Lieberman-AidenE,DekkerJ,2009，Science]和阮一駿教授研发的ChIA-PETChromatinInteractionAnalysiswithPaired-EndTagSequencing[ZhangY,2013,Nature]等两大类技术因为可以用来揭示全基因组水平上的不同距离基因或转录因子与转录调控元件间的基因互作，构建染色质三维拓扑构象等用途而备受研究人员重视[WitE.D,2012,GenesDevelopment]。[0004]Hi-C技术是在染色质构象捕获技术chromosomeconformationcapture，3C基础上发展起来的，通过高通量测序技术，探索全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系，通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行解析，获得高分辨率的染色质互作图谱及三维结构信息。该技术的优点突出，1不限制特定互作蛋白为局限，可以揭示全基因组范围内染色质三维互作，2数据量全，可以进行以“全对全”染色质三维互作分析。自2009年以来，通过Hi-C技术，研究人员已成功获取了人类、小鼠、果蝇和拟南芥等模式物种一些组织与细胞的全基因组染色质互作频率、互作调控网络和三维结构的可视化信息[GiorgettiL，2016，Nature];揭示了较大的核染色质区间（常染色质和异染色质及染色质相关结构域在三维空间位置上的状态与功能关系[VietriR.M，2015，CellReports]Ji-C技术可以产生无差别的染色质远端交互作用相关数据，用于建立三维基因组的基本空间结构，分辨率越高，Hi-C染色质互作数据就会越详实，可以发现更多的基因组中与染色质三维折叠和基因调控功能密切相关的结构域、互作元件[DixonJ.R,RenB，2012,Nature];其中BingRen等在分辨率40K左右还研究提出了一种被之命名为拓扑相关结构域TADs染色质结构域；当分辨率更高的时候，一些新兴的结构域，如sub-TADs、individualloops和insulationneighborhood[DixonJ.R,RenB，2016,MolecularCell],以及相对保守的FIREsfrequentlyinteractingregions[SchmittA.D,2016,CellReports]等，随着研究工作的不断深入也都被一一揭示出来了，这些结构域包含了多种基因、互作增强子及与基因组抑制或激活相关的甲基化标记[StefanSchoenfelderT.S，2010,NatureGenetics]，这为进一步整合基因组结构信息与生物学性状的功能提供了更详细的信息;此外，Hi-C技术还被成功应用到基因组单体型分析[KorbelJ.0,2013,NatureBiotechnology]和辅助组装基因组[BurtonJ·Ν,2013,NatureBiotechnology]等前沿研究领域。更重要的是，在农业育种、病害保护和人类健康方面的研究潜力巨大。[0005]与此同时，与Hi-C相关的基因组学技术也在这些年得到了飞速发展，如2013年InsituHi_C[DurandN.C，2014，Cell]和Single-cellHi_C[NaganoT，2013，Nature]单细胞!1;[-0技术），2014年0卩1：11代-!1;[-0[3。11。6111^11613,2015,6611。11161?6861'。11]，2015年DNaseHi-C和DNaseCapture-Hi_C[MaW，2015,NatureMethods]，以及2016年的insituDNaseHi_C[RamaniV，2016,NatureProtocols]。这些技术的出现是对传统Hi-C技术的进一步发展和提高，它们从1实验材料的需求，2实验材料的处理，4获取三维互作数据的全基因组分辨率，和5降低原技术中的假阳性率等不同方面对原技术进行了改进和提高，这些技术的研发和应用为三维基因组学的进一步发展和应用打下了广阔的基础。[0006]基因组测序研究，样品选择和制备是重要环节，是获取科学有效的生物信息分析成果的前提，而样本准备的难易程度也决定了是否能顺利开展课题、项目，Hi-C主要以细胞为操作对象。获得细胞的方法主要是两种:培养细胞系和从组织直接分离细胞。目前，常规Hi-C技术细胞的数量要达到2.5X10725milIion个（ErezLieberman-Aiden，2009，Science。标准试验技术需要的细胞量比较大，收集足够细胞耗时；实验材料数量要求较多，导致细胞培养成本提高;所需细胞数量较大也会导致实验误差增大。针对此，之前研发了一种高效的、基于通用单培养皿6CM-10CM细胞量l-3million就能进行Hi-C测序建库的技术——eHi-C。[0007]eHi-C最大的优势是将细胞量从25mi11ion降到了Imi11ion降低25倍）。但是，其分辨率与常规Hi-C在同一数据量水平上是一致的。所获数据在全基因组范围内互作分辨率还具有很大的提升空间。现有这些技术很难在数据的全面性与实验材料用量两者间取得一个平衡;而新出现的单细胞Hi-C技术等所获取的数据覆盖度较差，只能部分显示基因互作较强的结构域，所获数据在全基因组范围内互作分辨率低。发明内容[0008]本发明一个目的是提供一种细胞eHi-C2.0测序文库的制备方法。[0009]本发明提供的制备方法，包括如下步骤：[0010]1裂解细胞得到染色质，再酶切所述染色质，得到酶切后DNA;[0011]所述酶切所用的限制性内切酶为HpyOMIV和MboI;[0012]2将所述酶切后DNA依次经标记物标记和钝端连接，得到环化产物；[0013]3向所述环化产物中引入内参环状共沉淀DNA分子，得到混合物;再用限制性外切酶酶切所述混合物，得到去除线性DNA分子的混合物；[0014]所述限制性外切酶为Lambda和ExonucleaseI;[0015]4将所述去除线性DNA分子的混合物进行超声打断，再用免疫磁珠从打断产物中抓取带有所述标记物的DNA片段；[0016]5用所述带有所述标记物的DNA片段制备eHi-C2.0测序文库。[0017]上述方法中，[0018]所述裂解细胞为依次裂解所述细胞的细胞膜和细胞核，得到染色质；[0019]所述裂解细胞的细胞膜包括如下步骤:用含有质量百分含量0.1%SDS和质量百分含量1%PI的裂解缓冲液裂解细胞，离心收集上清液，得到裂解后产物；[0020]所述裂解所述细胞核为先用含有质量百分含量为1%SDS和质量百分含量1%PI的裂解缓冲液裂解，再用含有质量百分含量0.1%SDS和质量百分含量1%PI的裂解缓冲液裂解，收集上清液，得到染色质；[0021]所述含有质量百分含量0.1%SDS和质量百分含量1%PI的裂解缓冲液，配方由质量百分含量l%PI、150mMNaCUlmMEDTA、体积百分含量l%TritonX-100、质量百分含量〇.1%脱氧胆酸钠、质量百分含量〇.I%SDS和浓度为50mM、pH值为7.5HEPES-K0H缓冲液组成；[0022]所述含有质量百分含量为1%SDS和质量百分含量1%PI的裂解缓冲液，配方由质量百分含量l%PI、150mMNaCUlmMEDTA、体积百分含量l%TritonX-100、质量百分含量〇.1%脱氧胆酸钠、质量百分含量1%SDS和浓度为50mM、pH值为7.5HEPES-K0H缓冲液组成；[0023]或所述离心的条件为4°C500g离心10-15min。[0024]上述方法中，[0025]所述用带有所述标记物的DNA片段制备eHi-C2.0测序文库依次包括如下步骤:将所述用带有所述标记物的DNA片段依次末端修复、加尾反应、加接头、PCR扩增和选择文库；[0026]所述PCR扩增的条件为：先98°C预变性Imin再98°C变性15s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共进行11个循环;再72°C延伸5min。[0027]所述选择文库大小为200bp_700bp。[0028]上述方法中，[0029]所述酶切为将所述染色质用限制性内切酶缓冲液重悬，得到重悬后染色质；将所述重悬后染色质和所述限制性内切酶混匀，反应，得到酶切后DNA;[0030]或在所述重悬和所述反应之间还包括如下步骤：向所述重悬后染色质中加入SDS孵育，所述SDS在所述孵育的反应体系中的质量百分含量为0.1%。[0031]上述方法中，[0032]所述标记物标记为将带有标记物的dNTP引入所述酶切后DNA中；[0033]或所述标记物为生物素；具体所述标记物通过biotin-14-dCTP引入，具体体现如下：3.3uldNTP混合物（1.5ulIOmMdATP，1.5ulIOmMdGTP，1.5ulIOmMdTTP和37.5ul0.4mMbiotin-14-dCTPThermoFisher;19518018和Iul5UulKlenowNEB酶加入酶切后DNA中，混匀，37°C孵育75min，每10分钟摇晃一次，补齐并标记DNA末端，之后放于冰上，得到标记后DNA分子。[0034]或所述钝端环化连接的条件为16°C孵育12-18h;[0035]或，在所述标记物标记和所述钝端连接之间还包括如下步骤：向所述标记物标记的产物中加入SDS孵育，所述SDS在所述孵育的反应体系中的质量百分含量为1.5%;[0036]或，在步骤2的钝端连接后还包括如下步骤：向所述环化产物中加入SDS孵育，所述SDS在所述孵育的反应体系中的质量百分含量为1-1.5%，具体为1.5%。[0037]或所述钝端连接的条件为16°C孵育12-18h过夜）。[0038]所述标记物标记钝端连接采用的连接反应液由1^如11乂-100、83六）了？、1^8-HCl、MgCl2、DTT和水组成。[0039]所述超声打断的Intensity为5。[0040]上述方法中，[0041]在所述步骤2和3之间和所述步骤3和4之间，均有将上一步产物进行DNA纯化的步骤，[0042]所述DNA纯化采用磁珠纯化的方式；[0043]所述步骤2和3之间磁珠纯化采用磁珠原液的稀释液进行，所述稀释液的稀释倍数为16倍；[0044]所述步骤3和4之间磁珠纯化采用磁珠原液进行。[0045]所述稀释采用的稀释缓冲液为AmpureBeadsBuffer，其由质量百分含量10%PEG8000水溶液，1.25MNaCl，IOmMMgCl2水溶液组成。[0046]上述方法中，[0047]所述内参环状共沉淀DNA分子为环状质粒；[0048]所述环状质粒具体为质粒PGL4.23。[0049]上述方法中，[0050]步骤1中，所述细胞的数量为小于lmillion;[0051]或所述细胞的数量为0.1-0.3million。[0052]由上述的方法制备的eHi-C2.0测序文库也是本发明保护的范围；[0053]或上述方法或所述制备的eHi-C2.0测序文库在细胞eHi-C2.0测序中的应用也是本发明保护的范围。[0054]本发明另一个目的是提供一种细胞eHi-C2.0测序方法。[0055]本发明提供的细胞eHi_C2.0测序方法，包括如下步骤：1上述的建库法的步骤，得到eHi-C2.0测序文库;2对所述eHi-C2.0测序文库进行测序。[0056]本发明第3个目的是提供一种用于细胞eHi-C2.0测序的试剂盒。[0057]本发明提供的试剂盒，包括上述建库法中所有试剂中一种或其任意组合，具体为含有质量百分含量〇.1%SDS和质量百分含量1%PI的裂解缓冲液、含有质量百分含量为1%SDS和质量百分含量1%PI的裂解缓冲液、MboI酶、HpyCMIV酶、稀释缓冲AmpureBeadsBuffer、内参环状共沉淀DNA分子如PGL4.23、Lambda和ExonucleaseI酶。[0058]本发明是在eHi-C基础上开发一种细胞数量更少1-3XIO50.1-0.3million个降低250倍）、更高效、更高分辨率、通用单盘或单孔培养皿细胞量可制备多个Hi-C文库的全基因组染色质构象技术强化版eHi-C2.0。[0059]上述建库方法，主要针对极少量0.1-0.3million细胞进行群体细胞高效全基因组染色质构象技术eHi-C测序建库。与ErezLieberman-Aiden的方法（需要25mi11ion个细胞.Science,2009、MatteoVietriRudan的方法（需要lOmillion.CellReport,2015相比，细胞需要量少，更易获得实验材料，大大节约收集材料时间，大大降低细胞培养成本，大大降低试剂耗材成本，在保证群体细胞特征前提下大大降低试验误差。[0060]上述建库方法，还主要针对常规Hi-C和eHi-C在同等数据量条件下分辨率相当的局限，改良主要步骤，在同等数据量条件下能有效提高分辨率，不以盲目提高上机成本和下机数据量为提高分辨率代价，大大降低测序上机成本。实践上，在常规Hi-C和eHi-C只能达至IJlMb时，同等数据量条件下，eHi-C2.0达到了IOOkb提高十倍）；理论上，在数据量足够大的时候，常规Hi-C方法和eHi-C分辨率为4096bp，而eHi-C2.0分辨率可以达到260bp理论极限值提高四倍）.[0061]本发明所提供的方法适用于低至0.Imillion的群体细胞全基因组染色质构象技术eHi-C测序建库，与Hi-C标准方法ErezLieberman-Aiden，Science，2009和国内主流Hi-C测序公司需求细胞数量25mi11ion甚至IOOmiIion相比，具有以下优点：[0062]1应用本发明技术方案，能对数量低至0.Imillion细胞的进行全基因组染色质构象技术eHi-C建库测序。一个6cmCorningC2C12细胞量为3-4million，常规Hi-C需要养两盘建一个Hi-C文库，eHi-C—盘可建三个Hi-C文库，eHi-C2.0可以建30个Hi-C文库。大大降低细胞需要量、细胞培养成本和建库成本。本发明方法操作简单、与时倶进，能够适用于包括人、小鼠、猪等细胞系在内的哺乳动物体外培养的多种细胞系。[0063]2改良了常规Hi-C和eHi-C测序步骤，效果显著。细胞核穿孔裂解中，不需要再进行反复、机械、费时的细胞核团块敲碎工作，每一步均加样吹打即可，操作流畅；酶切中，采用更高效、省时的双酶切;钝末端连接中，连接时间足够长，保证环状互作DNA的产量。DNA磁珠纯化中，将磁珠稀释到16倍的全体下高效吸附理想产量的环状DNA，大大节约磁珠成本。对于线性消除酶切，引入了更稳定的环化的共沉淀DNA为对照，Lambda和ExonucleaseI外切酶酶组合高效切碎线性DNA，尽量消除未环化生物素标记的DNA“噪音”和线性的DNA杂质。且与JobDekker的标准Hi-C相比，将生物素DNA免疫磁珠纯化步骤提前，而且出库前PCR时才进行切胶纯化反应，大大降低了样品损耗。[0064]3全程利用磁珠纯化方式，与常规Hi-C的酚仿抽提相比，简化了步骤，节约了试剂，尤其Tris-饱和酚和氯仿都是剧毒挥发性试剂。[0065]4目前市场上未有Hi-C建库试剂盒，本发明能开发成适用于与现阶段最流行的Miseq,Hiseq3000和HiSeqXTen等几乎所有二代测序仪的一种细胞易得省时、操作快捷省事、商业前景广阔省心的高效高分辨率全基因组染色质构象技术eHi-C2.0建库试剂盒。也能基于此试剂盒开发成一种可用于〇.1-0.3miIion群体细胞的自动加样eHi-C2.0建库装置。附图说明[0066]图1为eHi-C2.0本发明主要步骤流程图。[0067]图2为本发明细胞分步裂解优化处理。[0068]图3为本发明酶切所用的酶的对比试验结果。[0069]图3-a为四位单酶切和四位双酶切时间梯度0h、4h、8h、16h结果比较。图中各泳道依次为：第1道，Ikb和IOObp等量混合Ladder;第2道，Oh对照（不切）；第3道，MboI单酶切4h;第4道，MboI单酶切8h;第5道，MboI单酶切16h;第6道，HpyCMIV单酶切4h;第7道，HpyOMIV单酶切8h;第8道，HpyOMIV单酶切16h;第9道，MboI和HpyOMIV双酶切4h;第10道，MboI和HpyCH41V双酶切8h;第11道，MboI和HpyCH41V双酶切16h。[0070]图3-b为六位酶切HindIII的酶切效果（引用自《GrobS,GrossniklausU.ChromatinConformationCapture-BasedAnalysisofNuclearArchitecture》）。其中Pre表示未切的完整基因组。Post表示过夜HindIII过夜（约16h酶切后结果。HiC表示酶切后连接结果。[0071]图4为三种外切酶组合线性消除效率实验结果。[0072]整个图中一共三条带相应分别为开环DNA、线性DNA和超螺旋。图中各泳道依次为：IkbLadder,梯度为1000个碱基对的标准分子量;质粒，PGL4.23质粒;线性，BamHI线性化质粒后产物；LRL-切（质粒+线性），Lambdabuffer中Lambda与RecJF外切酶组合去切割250ng质粒和250ng线性化产物DNA混合的得到（质粒+线性混合物；LRC-切（质粒+线性），CutSmartbuffer中Lambda与RecJF外切酶组合去切割250ng质粒和250ng线性化产物DNA混合的得到（质粒+线性）混合物；LIC-切（质粒+线性），CutSmartbuffer中Lambda与ExonucleaseI外切酶组合去切割250ng质粒和250ng线性化产物DNA混合的得到（质粒+线性）混合物；LIC-切质粒，CutSmartbuffer中Lambda与ExonucleaseI外切酶组合去切割500ng质粒；LIC-切线性，CutSmartbuffer中Lambda与ExonucleaseI外切酶组合去切割500ng线性化产物DNA;超螺旋Ladder，准确反映超螺旋大小梯度的标准分子量。上样量统一为40ng〇[0073]图5为互作环状DNA被Covaris220超声波片段化后的E-gel电泳检测结果。[0074]图中，1，1吐1^1«^;?4.23，打断前（质粒对照）；？：，打断后（质粒对照）。即1、即2为两个处理组;均集中在300bp.[0075]图6为PCRE-gel检测结果。[0076]M，100bpMarker;PCR11个循环，NP1、NP2为两个处理组。[0077]图7为Mi-seq上机测序结果质控一碱基比例图（％、Q值分布柱形图、Q值热图、大于Q30Q值彡30的值所占的百分比。[0078]图8为Mi-seq下机后Hi-C数据分析二维互作热图。[0079]a，NPl和NP2组数据合并后（双酶切）所有染色体互作热图（IMb分辨率）；b，NPl和NP2组数据合并后双酶切）1号染色体互作热图（IMb分辨率）；c，NPl和NP2组数据合并后双酶切）1号染色体互作热图（IOOKb分辨率）；e，N0组双酶切所有染色体互作热图（IMb分辨率）；f，N0组双酶切）1号染色体互作热图（IMb分辨率）；g，N0组双酶切）1号染色体互作热图（IOOkb分辨率）；h，P和P’组Hindin酶切）数据合并后所有染色体互作热图（IMb分辨率）；i，P和P’组HindIII酶切）数据合并后1号染色体互作热图（IMb分辨率）；j，P和P’组Hindin酶切数据合并后1号染色体互作热图（IOOKb分辨率下几乎为空数据）。[0080]图9为eHi-C2.0与eHi-C1.0主要技术细节对比图。具体实施方式[0081]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0082]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，均为自常规测序建库生化试剂商店（ThermoFisher、NEB、KAPA、Illumina等）购买，所用水均为UltrapureDistilledWaterThermoFisher。[0083]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。[0084]下面将结合参考附图和实施例来详细说明本发明。[0085]实施例1、基于少量细胞eHi-C2.0测序文库的制备及其在Hi-C测序中的应用[0086]图1为基于0.Imi11ion细胞的高效高分辨率eHi-C2.0测序流程图。[0087]一、裂解细胞制备染色质（图2为细胞分步裂解优化处理主要步骤。）[0088]1、细胞收集与交联固定[0089]1当培养皿（10CM中细胞汇合率达到80-90%的时候C2C12细胞（ATCC®CRL-1772™数约6-8mi11ion改良牛鲍尔细胞计数板精确结果）；[0090]2向其中加入质量百分含量37%甲醛水溶液280ul，使其终浓度为1%，将培养皿放到旋转器上常温摇晃10分钟或37°C培养箱孵育IOmin;[0091]3向其中加入2.5M甘氨酸水溶液0.89ml，使其终浓度为0.2M猝灭甲醛，放回旋转器常温振荡5分钟或常温摇晃几下，均匀后，静置5分钟）；[0092]4去除培养液，用IOml预冷的IXPBS含有IXPI抑制剂洗细胞两次；[0093]5去除大部分I3BS并在盘中剩余0.5mlroS，用细胞铲刀将细胞刮下，用移液器将细胞吸入新1.5ml离心管中，放在冰上，用Iml质量百分含量0.5%BSAPBS冲洗细胞，收集剩余的细胞到该离心管中；[0094]6350g4°C离心5min;小心去除上清，得到固定后细胞，冻存_80°C或直接进行下一步。[0095]2、细胞膜裂解[0096]1取一管_80°C冻存的（一管约6-8million固定后细胞，解冻团块，放于冰上，加入冰冷的IXPBS分装，充分吹打混匀，0.Imi11ion管（仅十万个细胞），分为三管，命名为NPl、NP2和NO，进行后续eHi-C2.0标准步骤建库，分两批次进行建库，NPl、NP2为第一批次，NO为第二批次。本实施例1仅展示出第一批次的建库记录，第二批次的建库方法与第一批次完全一样。[0097]2用1.0ml0.1%SDSFA细胞裂解缓冲液含有质量百分含量0.1%SDS和质量百分含量1%?1的裂解缓冲液，配方为：质量百分含量1%?1，5〇11^?!17.5册1^3-10!1，15〇11^NaCl，lmMEDTA，体积百分含量l%TritonX-100，质量百分含量0.1%脱氧胆酸钠，质量百分含量〇.l%SDS重悬上述1的细胞团；在4°C冷室中旋转裂解15min.4°C500g离心15min.小心去除上清。[0098]3重复步骤2，收集沉淀，得到细胞核团块。[0099]细胞团块主要是细胞核，呈白色。-80°C保存细胞核团块或者继续进行细胞核裂解。[0100]3、细胞核裂解[0101]1解冻-80°c保存上述2得到的细胞核团块，放于冰上。[0102]2先用1.0ml1%SDSFA细胞核裂解缓冲液含有质量百分含量0.1%SDS和质量百分含量l%PI的裂解缓冲液，配方为：质量百分含量l%PI，50mMpH7.5HEPES-K0H，150mMNaCl，ImMEDTA，1%体积百分含量TritonX-100,质量百分含量0.1%脱氧胆酸钠，质量百分含量1%SDS重悬细胞核团块;在4°C冷室中旋转裂解1511^11;101€20,00^离心151^11.小心去除上清。[0103]3直接加1.0ml0.1%SDSFA细胞裂解缓冲液含有质量百分含量0.1%SDS和质量百分含量1%?1的裂解缓冲液重悬，手动斡旋几次;在4°：冷室中旋转裂解151^11.41€20，OOOg离心15min.小心去除上清，得到染色质团片。[0104]二、酶切染色质[0105]1用500ulIXCutSmart®BufferNEB;#B7204S吹洗获得的上述一获得的染色质团片，4°C20，OOOg离心15min.小心去除上清。重复一次，最后将上清吸净。[0106]2加38ullXCutSmart®Buffer，重悬，用枪头吹碎团块，得到重悬后染色质碎片;再向重悬后染色质中，加入3.8ul质量百分含量1%SDS水溶液终浓度约为0.1%，65°C孵育IOmin，加入4.4ul体积百分含量10%TritonXlOO水溶液，混匀避免气泡。[0107]3加入IulMboI5Uul，NEBR0147L，在酶切体系中的终浓度为0.1037Uul和IulHpyCH4IV10Uul，NEBR0619L，在酶切体系中的终浓度为0.2075Uul共15U37°C双酶切8h，得到酶切后DNA。[0108]三、DNA末端标记和钝端环化连接[0109]1取3.3uldNTP混合物（1.5ulIOmMdATP，1.5ulIOmMdGTP，1.5ulIOmMdTTP和37.5ul0.4mMbiotin-14-dCTPThermoFisher;19518018和Iul5UulKlenowNEB酶加入酶切后DNA中，混匀，37°C孵育75min，每10分钟摇晃一次，补齐并标记DNA末端，之后放于冰上，得到标记后DNA分子；[0110]加入8.6ul质量百分含量10%SDS终浓度约1.5%65°C孵育30min，将酶灭活。之后迅速放置于冰上。[0111]2稀释连接：向上述1处理后的产物中添加新制备的608ul连接反应液59.4ul体积百分含量10%TritonX-100水溶液，59.4ulIOXligationbuffer500mMpH7.5Tris-HCl，100mMMgCl2JOOmMDTT;6.4ullOmgmlBSA水溶液；6.4ulIOOmMATP水溶液；477ul超纯水），混匀后加入4ulT4DNAligaselUul，吹打混匀，16°C孵育过夜，进行钝端连接，得到环化产物。[0112]3向上述环化产物中添加108.6ul10%SDS终浓度约1.5%。[0113]四、DNA纯化[0114]1为了解耦交联并裂解蛋白，向上述三处理后的每个样品管中加入4ulproteinaseK20mgml，65°C解育至少lh。[0115]216倍Beads稀释纯化：每管加入800ulAmpureXPbeadsBeckmanCoulter;A6388150ul原装Beads用AmpureBeadsBuffer质量百分含量10%PEG8000水溶液，1.25MNaCl，10mMMgC12水溶液稀释16倍到800ul，混匀，常温静置15min。[0116]3将含有beads的样品放于磁力架上，静置15分钟，溶液变澄清。[0117]4移液枪吸出上清液，加入700u1新鲜制备的80%E10H乙醇溶液，体积分数85%，清洗两次。添加时保证样品管始终在磁力架上，每次清洗时，常温孵育30秒。[0118]5第二次清洗时，略微旋转样品管，重新放回磁力架上，用IOul移液枪去除残余的EtOH，常温5min瞭干。[0119]6加入38ul超纯水，简单涡旋混合。放回磁力架，约5min后溶液变澄清，将上清液转移到新的1.5ml离心管中，得到纯化后环化产物。[0120]7吸Iul通过Qubit3.0精确测定DNA浓度，NPl产量为363.6ng，NP2产量为318.96ng,如表1，在理论预期值范围内200_400ng0.ImillioncelIs。这一阶段充分证明eHi-C2.0高效，比常规Hi-C的环化产物（包括全部的环化以后的环状DNA和未能环化的DNA产量高。[0121]上述常规Hi-C大约产量为5ug20millioncells,即约25ng0.Imillioncells。弓I自文南犬Lieberman-AidenE,DekkerJ.ComprehensiveMappingofLong-RangeInteractionsRevealsFoldingPrinciplesoftheHumanGenome[J].Science,2009,3265950:289.。[0122]表1为0.111^111〇116出-〇2.00嫩产量[0123][0124]注意：为高效操作并最大限度较少损失，从一、2步直到四、6步，始终在同一个1.5ml离心管中操作。[0125]五、引入环状共沉淀DNA[0126]1将200ng左右环状共沉淀DNA加入到上述得到的纯化后环状DNA中，得到加入质粒后的样品。[0127]上述环状共沉淀DNA为质粒PGL4.23PromegaE8411，添加是为了作为对照观察打断效果，大小为4283bp。[0128]2用LambdaNEB;M0262L和ExonucleaseINEB;M0293L外切酶在IXCutSmartbuffer中37°C消化Ih消除线性化DNA，增加环化效率）；具体:加入质粒后的样品38ul，10XCutSmart外切酶缓冲液5ul,Lambda外切酶2ul,ExonucleaseI外切酶2ul，得到消化后产物。[0129]六、DNA再次纯化[0130]1、再次纯化[0131]将上述五得到的消化后产物再次进行AmpureXPbeads纯化;具体如下：[0132]60ulAmpureXPbeads原液纯化加入消化后产物混匀，常温静置5min;将含有beads的样品放于磁力架上，静置5分钟，溶液变澄清。移液枪吸出上清液，加入500ul新鲜制备的80%Et0H乙醇，体积分数85%，清洗两次。添加时保证样品管始终在磁力架上，每次清洗时，常温孵育30秒。第二次清洗时，略微旋转样品管，重新放回磁力架上，用IOul移液枪去除残余的EtOH，常温5min晾干。加入130ulTE缓冲液，吸打或简单涡旋混合，得到纯化后环状共沉淀和环状DNA混合物。[0133]七、超声打断[0134]将130ul获得的纯化后环状共沉淀和环状DNA混合物Beads已经被除去）转移到microTUBEAFACovaris220管中，按程序设定（DutyCycle5%，[0135]Intensity5，CyclesperBurst200，Time240s打断环化DNA，得到片段化环状共沉淀和环状DNA混合物。[0136]检测超声打断效率，取部分片段化环状共沉淀和环状DNA混合物跑E-gel检测声波降解法的效率，结果如图5所示，图中NPl和NP2为片段化的环状共沉淀质粒DNAPGL4.23和环状DNA混合物的打断结果M，IkbMarker;P4.23,打断前（质粒对照）；PC，打断后（质粒对照）JPUNP2为两个处理组；均集中在300bp，可以看出，本发明的方法弥散，主带聚积在300bp，超声打断效果好。[0137]八、免疫磁珠抓取[0138]先混勾Dynabeads®MyOne™StreptavidinTl溶液（Lifetechnologies;65602，然后向每个PCR管中加入50ul混匀后的Dynabeads原溶液。用150ul2xBW缓冲液IOmMpH7.5Tris-HCl，lmMEDTA，2MNaCl清洗Beads两次（清洗时，轻弹管壁，常温800rpm简单旋转），放磁力架MagneticStand-96上至少2min，去除缓冲液。120ul2xBW缓冲液重悬。[0139]转移120ul上述七得到的片段化环状共沉淀和环状DNA混合物到120ul清洗过的Dynabeads悬浮液中（总体积240ul。常温孵育，并旋转仪器Intelli-Mixer混勾30min。用150ullxBW缓冲液用2X稀释一倍得到清洗Beads两次清洗时，轻弹管壁，常温800rpm简单旋转）放磁力架上至少2min，去除缓冲液。加25ul超纯水溶解Beads，得到生物素标记DNA片段，去除了环状共沉淀相关片段。[0140]之后步骤全伴随免疫磁珠进行。[0141]九、文库制备[0142]1、末端修复和加尾反应[0143]体系为：上述八得到的生物素标记DNA片段样品25ul,EndRepairA-Tailing缓冲液，3.5ul，EndRepairA-Tailing酶1.5ulKAPABiosystems;KK8502.[0144]轻轻涡旋震荡，冰浴，转移到PCR仪上立即进行孵育（20°C，30min;65°C，30min;4°C，，得到末端修复和加尾反应产物。[0145]2、加接头[0146]制备连接混合液（Adapter储存液（VAHTS™DNAAdaptersset3_set6forIlluminaIul，超纯水4ul，连接缓冲液15ul，DNA连接酶5ul，末端修复和加尾反应产物30ul。）完全混匀，轻微离心。快速进行Adapter连接。20°C孵育15min，得到加接头后产物。[0147]注意：为高效操作并最大限度较少损失，从八步直到九、2步，始终在同一个1.5ml离心管中操作。[0148]3、PCR扩增[0149]制备PCR混合物（2XΚΑΡΑHiFiHotStartReady预混液（ΚΑΡΑBiosystems;ΚΚ850220ul,IOXΚΑΡΑ文库扩增引物预混液ΚΑΡΑBiosystems;ΚΚ85022ul，得到的加接头后产物18ul，彻底混匀，简单离心。按如下程序设置PCR。预变性:98°Clmin;ll个循环变性:98°C15s;退火:60°C30s;延伸：72°C30s;终延伸：72°C5min;保存：10°Cmmin。得到PCR产物。[0150]磁珠1:1纯化后，20ul水溶出，20ulPCR产物全部上样跑E-gel，进行Smear条带观察质量控制，如图6,可以看出11个循环即可正好满足200-700bp环化以后超声波打断的结果的弥散条带以400bp为中心但比较宽，所以可测的有用信息片段就比较长。为了尽可能全面，所以最终选择200_700bp彡200bp可能会有接头700bp可能会有过度扩增的产物）的切胶范围。[0151]4、选择文库[0152]使用胶回收试剂盒进行大小200bp_700bp片段回收，即为eHi-C2.0测序文库。[0153]十、Mi-Seq测序[0154]利用Miseq@ReagentKitv3150CyclesPE75试剂盒进行Mi-seq测序，如图7。上机测序数据通过IlluminaSequencingAnalysisViewer进行结果评估。[0155]结果如图7第一批次NP1、NP2总的质控图），上机测序结果质控，碱基比例图（％结果显示无GC或AT分离，含量无偏离。Q值分布柱形图反映测序过程中不同阶段的数据质量，Q30平均值为94.8%，测序总体质量非常好。Q值热图，中间为Index，循环整齐均一。大于Q30Q值彡30的值所占的百分比显示所有循环的ReadsQ值大于30的比例，发现最小比例85%以上，说明处理后的数据质量均优良。显示出所建eHi-C2.0文库上机测序非常成功。[0156]NO批次所建eHi-C2.0文库上机测序也非常成功。[0157]十一、生物信息分析[0158]l、motif评估[0159]本实施例中，首次提出通过Python脚本正则表达式，使用特异的“motif”作为革巴序列去检索读长read文件去预测、评估Hi-C的数据质量方法。计算分为一下几类如表2:单一读长包含单motif«1;单一读长包含多motif彡2.由于Mi-seq测序为PE75测序，数据量局限，片段均值峰值为450bp左右，有大约三分之二在有效测序的间隔区。因此有效读长数仅包含单一读长包含单motif=1，然后直接乘以3倍去总预估互作有效数据占比，如表2。[0160]表2NP1、NP2、N0组互作有效数据占比评估[0161][0162]备注:单读长read重复，表示单一读长包含多motif彡2;有效读长reads数，表示单一读长包含单motif=1.[0163]2、Hi-C数据互作热图（Heatmap分析[0164]本实施例中，测序结果均为Mi-seq测序数据。eHi-C2.0的NP1+P2表示整合了NPl组和NP2组测序数据。[0165]平行对照组：[0166]eHi-C2.0的NO组:建库步骤与上述一至十完全，不同的是通过eHi-C2.0建库后通过Mi-seq测序仪单独上机得到Mi-seq测序水平的最大数据量），标记为N0。（约7个RawBaseG,30Mreads；[0167]eHi-C1.0的PP’组:P和P’两个处理组，利用eHi-C1.0方法建库（方法请见专利201610995880.X:—种高效的全基因组染色质构象技术eHi-C，Mi-seq测序后，数据整合得到PP’组eHi-C1.0和2.0流程对比请见，图9:[0168]1上述一中细胞膜裂解2中，在4°C冷室中旋转裂解15min.4°C500g离心5min.小心去除上清；[0169]2上述二中，酶切染色质采用的酶为HindIII，16h;[0170]3上述四中，DNA纯化Beads稀释液为原装Beads用Beadssolution质量百分含量30%PEG8000水溶液和5MNaCl水溶液按照体积比为1:1混匀稀释10倍[0171]4上述五中，环状共沉淀DNA为NLS-NgAg〇-pcDNA3.1;[0172]5上述五中，外切酶为LambdaNEB;M0262L和RecJfNEB;M0264L。[0173]通过bowtie2比对，Homerpipeline分析，得到图8结果，该数据量局限仅能包含为IMb分辨率和IOOkb分辨率（c和g，但是已经充分说明了问题。列出了所有染色体a、e、h、和染色体Ib、f、i之内和之间的互作模式;可以看出在Mi-seq数据量级别框架下，eHi-C2.0的数据无论数据量稍微大一些NO还是稍微小一些NP1+P2，IMb分辨率下均比较清晰，模块间对比度高。而且分辨率在IOOkb的时候可以看到互作区域。然而，eHi-C1.0数据在IOOkb分辨率时，已经几乎没有数据，输出为空集。所以eHi-C2.0可以具有得到更高的分辨率的潜力，在不以盲目大幅提高数据量为代价下，eHi-C2.0可以得到比常规Hi-C更高分辨率的结果，从而大大降低测序成本。[0174]eHi-C1.0主要是方法学创新，并针对l-3million的细胞数，用HindΙΠ酶，主要针对距离4kb以上互作，4Kb以下无信号，eHi-C2.0是升级版，针对0.1-0.3million细胞数，用双酶切，4Kb以下有信号，可以重点研究lKb-4kb的互作。[0175]实施例2、消除线性化DNA的限制性外切酶组合选择试验[0176]实施例1的步骤五中采用Lambda和ExonucleaseI进行消除环状DNA混合物中的线性化DNA，本发明在选择这两种酶组合酶切时做了如下限制性外切酶组合选择实验，用PGL-4.23质粒为环状DNA混合物进行试验：[0177]I、PGL_4.23质粒的获得:采用大肠杆菌转化，摇菌，质粒提取获得浓度为IlOngul质粒。[0178]2、线性pGL4·23-1获得：pGL4·23-1即为pGL4·23质粒（PromegaE8411进行BamHI酶切。体系如下：质粒23.4ul;BamHI5ul;10XCutsmartBufferNEBB7204s20ul;H2O151.6ul;Total200ul.37°C酶切lhour，酶切完成后用1.2倍酚氯仿进行纯化，得到纯化后线性产物浓度为:26.6ngul。[0179]3、酶切体系:采用250ngPGL-4.23质粒和250ng线性pGL4.23-1混合作为混合物，用表3所示的3种外切酶组合分别进行酶切：[0180]表3三种外切酶组合线性消除试验体系[0181][0182]其中LIC组合还进行了表4所示的酶切反应：[0183]LIC-切质粒：将LIC组合中的缓冲液替换为CutSmartbuffer，且用Lambda与ExonucleaseI外切酶组合去切割500ngPGL_4.23质粒；[0184]LIC-切线性：将LIC组合中的缓冲液替换为CutSmartbuffer，且用Lambda与ExonucleaseI外切酶组合去切割500ng线性pGL4·23-1。[0185]表4LIC外切酶组合线性消除试验体系[0186][0187]以上所有酶切体系都是控制在37°C，酶切时间lh。酶切完后采用酚氯仿纯化后跑胶。[0188]结果如图4所示，Lane2_4分别展现质粒，线性，以及混合后的三种带型；Lane5LRL-切（质粒+线性）重复了eHi-C1.0酶切结果；lane6展现LRC-切（质粒+线性）展现了buffer可替代性；lane7LIC-切质粒和线性-为了展现LIC-切质粒和线性的酶切组合都能把线性条带切掉，提供了一个新组合;可以看出，LIC对于的酶切效果等价于LRC和LRL，线性几乎完全消失。进一步地，Lane8LIC-切质粒，和Lane9LIC-切线性更好的展现了酶切线性条带的效果，仅有线性时完全消除。因此，本发明的实施例中优选LIC。[0189]实施例3、酶切染色质的酶组合筛选试验[0190]实施例1的步骤二中采用MboI和HpyOMIV进行酶切染色质，本发明在选择这两种酶组合酶切时做了如下酶组合选择实验：[0191]1、取6.6million细胞管，加到660ul，用瑞宁白枪头吸IOul即为0·lmillion分装到10个1.5EP管中，进行实施例1一、二操作，只是在二3步的酶切时分为如下几组：[0192]MboI单酶切组，加2ulMboI5Uul，NEBR0147L;[0193]HpyOMIV单酶切组：加2ulHpyCH4IV10Uul，NEBR0619L;[0194]MboI和HpyOMIV双酶切组MH:加IulMboI5Uul，NEBR0147L和IullOUul，NEBR0619L的HpyCH4IV;[0195]上述各组分别酶切0h、4h和8h如图3-a。[0196]2、酶切后，加如SDS使之在反应体系中的质量百分含量为1.5%，直接进行四的1步骤，然后1:1.2磁珠纯化DNA，因此，跑胶时，每孔统一上IOul注满胶孔）。[0197]eHi-C1.0中的所用的HindΙΠ酶，过夜（约16h酶切效果如图3-b.引用自文献《GrobS，GrossniklausU.ChromatinConformationCapture-BasedAnalysisofNuclearArchitecture[M]PlantEpigenetics.2017.[0198]结果如图3,可以得出：[0199]①双酶切对基因组切割完全，双酶切4h主带在2500bp左右，双酶切8h和16h相当，主带在1500bp左右。[0200]②单酶切由于其位点局限，效果不如双酶切，单酶切切割不完全MboI和DpnI均为四碱基酶，且识别位点一模一样，市面上Hi-CDpnI单酶切具有很大局限）。肺〇I单酶切比HpyOMIV单酶切好一些。[0201]③eHi-C2.0选用HpyOMIV和Mbo頂每切8h。[0202]④与eHi-C1.0的经典Hi-CHindIII酶切相比。HindIII酶切片段比双酶切大。因此可以根据研究的互作大小、成本、研究目的需要，进行选择1.0还是2.0的酶切步骤。[0203]实施例4、离心时间减少细胞DNA损失试验[0204]1、取6.6million细胞管，加到660ul，用瑞宁白枪头吸IOul即为0·Imillion分装到2个1.5EP管中，标记为5min组和15min组。进行实施例1一、二操作，只是在一2和3步的离心时：5min组离心5min;15min组离心15min.[0205]2、二3步双酶切后，直接加10%SDS使之在反应体系中SDS的质量百分含量为1·2%，直接进行四的1步骤，然后1:1·2XPbeadsBeckmanCoulter;A63881磁珠纯化DM。[0206]结果如表5，可以得出：500g离心5min在0.Imi11ion细胞量时损失大，调整为15min后，损失很少。（在1.0中，初始细胞量比较大，所以该步离心不是大问题，为缩短时间，5min即可。在2.0中，细胞量少，离心充分就显得尤为重要。）[0207]表5为0·Imi11ioneHi-C2.0减少细胞DNA损失试验[0208]

权利要求：1.一种细胞eHi-C2.0测序文库的制备方法，包括如下步骤：1裂解细胞得到染色质，再酶切所述染色质，得到酶切后DNA;所述酶切所用的限制性内切酶为HpyOMIV和MboI;2将所述酶切后DNA依次经标记物标记和钝端连接，得到环化产物；3向所述环化产物中引入内参环状共沉淀DNA分子，得到混合物;再用限制性外切酶酶切所述混合物，得到去除线性DNA分子的混合物；所述限制性外切酶为Lambda和ExonucleaseI;4将所述去除线性DNA分子的混合物进行超声打断，再用免疫磁珠从打断产物中抓取带有所述标记物的DNA片段；5用所述带有所述标记物的DNA片段制备eHi-C2.0测序文库。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述裂解细胞为依次裂解所述细胞的细胞膜和细胞核，得到染色质；所述裂解细胞的细胞膜包括如下步骤:用含有质量百分含量0.1%SDS和质量百分含量1%PI的裂解缓冲液裂解细胞，离心收集上清液，得到裂解后产物；或所述裂解所述细胞核为先用含有质量百分含量为1%SDS和质量百分含量1%PI的裂解缓冲液裂解，再用含有质量百分含量〇.1%SDS和质量百分含量I%PI的裂解缓冲液裂解，离心收集上清液，得到染色质；或所述离心的条件为4°C500g离心10_15min。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述用带有所述标记物的DNA片段制备eHi-C2.0测序文库依次包括如下步骤:将所述用带有所述标记物的DNA片段依次末端修复、加尾反应、加接头、PCR扩增和选择文库；所述PCR扩增的条件为：先98°C预变性Imin再98°C变性158,60°：退火3〇8,72°：延伸30s，共进行11个循环;再72°C延伸5min。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述酶切为将所述染色质用限制性内切酶缓冲液重悬，得到重悬后染色质；将所述重悬后染色质和所述限制性内切酶混匀，反应，得到酶切后DNA。5.根据权利要求2-4中任一所述方法，其特征在于：所述标记物标记为将带有标记物的dNTP引入所述酶切后DNA中；或所述标记物为生物素；或所述钝端环化连接的条件为16°C孵育12-18h;或，在所述标记物标记和所述钝端连接之间还包括如下步骤：向所述标记物标记的产物中加入SDS孵育，所述SDS在所述孵育的反应体系中的质量百分含量为1.5%;或，在步骤2的钝端连接后还包括如下步骤：向所述环化产物中加入SDS孵育，所述SDS在所述孵育的反应体系中的质量百分含量为1_1.5%。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：在所述步骤2和3之间和所述步骤3和4之间，均有将上一步产物进行DNA纯化的步骤，所述DNA纯化采用磁珠纯化的方式；所述步骤2和3之间磁珠纯化采用磁珠原液的稀释液进行，所述稀释液的稀释倍数为16倍；所述步骤3和4之间磁珠纯化采用磁珠原液进行。7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述内参环状共沉淀DNA分子为环状质粒；所述环状质粒具体为质粒PGL4.23。8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：步骤1中，所述细胞的数量为小于Imi11ion;或所述细胞的数量为〇.l-〇.3million。9.由权利要求1-8中任一所述的方法制备的eHi-C2.0测序文库；或权利要求1-8中任一所述方法或所述制备的eHi-C2.0测序文库在细胞eHi-C2.0测序中的应用；或，一种细胞eHi-C2.0测序方法，包括如下步骤：1权利要求1-8中任一所述的建库法的步骤，得到eHi-C2.0测序文库;2对所述eHi-C2.0测序文库进行测序。10.—种用于细胞eHi-C2.0测序的试剂盒，包括权利要求1-8中任一所述的建库法中所有试剂中一种或其任意组合。

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