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申请/专利权人：上海理工大学

摘要：本发明公开一种嗜热链球菌Streptococcus thermophilus Benshit及其应用。所述嗜热链球菌Streptococcus thermophilus Benshit从新疆奶疙瘩中筛出，其保藏编号为CGMCC No.12098。嗜热链球菌Streptococcus thermophilus Benshit在乳糖为主要碳源时，EPS产量可达到160 mgL；其作为发酵剂用于单独生产EPS，或作为发酵剂用于生产嗜热链球菌发酵乳制品，由于EPS产量高，因此其作为发酵乳制品发酵剂时，可以显著提高发酵乳制品的粘度，改善发酵乳制品的组织状态，使发酵所得的发酵乳制品具有良好的风味。

主权项：1.一种嗜热链球菌Streptococcus thermophilus Benshit,保藏编号为CGMCC No.12098。

全文数据：嗜热链球菌StreptococcusthermophiIusBenshit技术领域[0001]本发明涉及一种嗜热链球菌及其用途，更具体的说是涉及一种嗜热链球菌StreptococcusthermophiIusBenshit及利用其作为发酵剂用于生产胞外多糖、嗜热链球菌发酵乳制品或嗜热链球菌奶酪等。背景技术[0002]嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus是一种重要的工业乳酸菌（LacticAcidBacteria,LAB，被美国和欧盟确定为93个链球菌属中唯一的公认安全菌种。作为一种重要的商业发酵剂，广泛应用于酸奶和奶酪等发酵乳制品的生产中。[0003]嗜热链球菌可以合成胞外多糖Extrapolysaccharide，以下简称EPS，EPS是在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、分泌到环境中的水溶性多糖。在乳制品生产中，嗜热链球菌及其产生的EPS具有的粘性、稳定性，可以有效地改善嗜热链球菌发酵乳的流变学特性和质构特性，避免乳清析出；同时，可以改善润滑感和风味，但是，目前的嗜热链球菌Streptococcusthermophilus在乳糖为碳源进行发酵的条件下，合成的胞外多糖中最高仅为〜90mgL[1]。[0004]并且国内对嗜热链球菌发酵剂制备还不完善，生产的发酵乳制品质地不高等问题导致产业化应用程度不高。随着我国乳品工业化的发展，对嗜热链球菌发酵剂的需求越来越大，应用前景非常广阔。有关筛选高产EPS嗜热链球菌等相关研究成为当前研究的一个热点，具有非常重要的经济和社会效益。[0005]综上所述，目前的嗜热链球菌由于存在产EPS量低等技术问题，从而使得嗜热链球菌用于发酵乳制品生产时影响最终所得的发酵乳制品的粘度、质构和口感等方面的性能，因此，迫切需求一种产EPS量高的嗜热链球菌，使其在用于发酵乳制品生产时能够有效的改善发酵乳制品的粘度、质构和口感等。[0006]参考文献：[0007]1·Li，D·;Li，J·;Zhao，F·;Wang，G·;Qin，Q·;Hao，Y·，TheinfluenceoffermentationconditiononproductionandmolecularmassofEPSproducedbyStreptococcusthermophilus05-34inmilk-basedmedium.FoodChem2016,197,367-72.[0008]2.冯小婉，夏永军，王光强，艾连中.产胞外多糖植物乳杆菌的筛选及粗多糖的活性研究[J]·食品科学，2016,3713:125-129.发明内容[0009]本发明目的之一是为了解决现有技术中的嗜热链球菌产EPS量低等技术问题而提供一种产EPS量高的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit0[0010]本发明目的之二在于利用上述的一种嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit作为发酵剂用于单独生产EPS。[0011]本发明目的之三在于利用上述的一种嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit作为发酵剂用于生产嗜热链球菌发酵乳制品，由于嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit在乳糖为碳源的条件下发酵，产EPS最高可达160mgL，从而有利于改善嗜热链球菌发酵乳制品的粘度和质地，在食品工业中具有良好的价值。[0012]本发明的技术方案[0013]一种嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit，是一种属于细菌类链球菌属的菌株，该菌株是从中国新疆和田奶疙瘩中分离得到的，于2016年1月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏，其编号为CGMCCNo.12098。[0014]上述的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit菌株具有如下微生物学特征：[0015]1、形态特征[0016]嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshitCGMCCNo·12098菌株革兰氏染色为紫色呈阳性，在显微镜下观察细胞形态为链球状，无芽孢形成；[0017]2、培养学特征[0018]在LM7平板上划线分离，42°C厌氧，培养24-48h，菌株生长良好，其菌落为呈椭圆形或类圆形，边缘整齐，菌落大小一般为2〜3_，乳白色；[0019]3、生理生化特征[0020]接触酶和氧化酶反应呈阴性，发酵葡萄糖不产气；[0021]⑷、耐药性[0022]对氨苄西林、阿莫西林、四环素、红霉素、米诺环素、万古霉素、复方新诺明和克林霉素药物敏感，对庆大霉素、卡那霉素、萘啶酸和诺氟沙星药物不敏感，具体见下表：[0023]嗜热链球菌Benshit耐药性试验[0025]表中注:-表示耐药;+表示中度敏感;++表示敏感[0026]5、碳源同化[0027]阳性:乳糖、半乳糖、葡萄糖；[0028]阴性:L-木糖、D-木糖；[0029]⑹、运动性:无运动性；[0030]7、生长最适宜温度:37°C;[0031]8、稳定性:该菌种经传代20次后，依然保持性状稳定，因此具有良好的传代稳定性。[0032]利用上述嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit作为发酵剂用于生产EPS的方法，具体包括如下步骤：[0033]1、将保藏于脱脂牛乳培养基中的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit，按3%vv接种量接入灭菌脱脂牛乳培养基中，42°C静置培养IOh进行活化，得到活化好的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit;[0034]所述的保藏于脱脂牛乳培养基中的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit，按每升计算，含有嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit的数量至少为l*101QcfuColony-FormingUnits，指单位体积中的细菌群落总数）；[0035]2、将活化好的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit按3%vv接种量接入LMl7液体培养基中，37°C静置培养12-24h，得到种子液；[0036]3、发酵培养[0037]将步骤2所得的种子液以3%vv的接种量接种于LM17液体培养基中，在37°C条件下静置培养24h，得到发酵液；[0038]4、将步骤3所得的发酵液控制温度为4°C、转速为SOOOg进行离心20min，去沉淀，收集所得的上清液1;[0039]采用旋转浓缩的方法，控制温度为50°C，对上述所得的上清液1进行浓缩至原体积的13,得到浓缩液1，将所得的浓缩液1于沸水浴中IOmin以失活可降解多糖的酶后，然后在浓缩液1中加入体积百分比浓度为80%wv的三氯乙酸的水溶液至三氯乙酸终浓度为4%wv，静置过夜，再次控制温度为4°C、转速为9000g进行离心20min除去沉淀蛋白，收集所得的上清液2;[0040]采用旋转浓缩的方法，控制温度为50°C，对上述所得的上清液2进行浓缩至原体积的13,得到浓缩液2,在所得的浓缩液2中加入体积百分比浓度为95%vv的乙醇溶液至乙醇的终浓度为75%vv，4°C静置24h，控制温度为4°C、转速为8000g进行离心20min，收集所得的沉淀；[0041]将上述所得的沉淀用去离子水溶解，控制温度为4°C、转速为SOOOg进行离心20min去沉淀，收集所得的上清液3;[0042]上述沉淀和去离子水的用量，按重量比计算，沉淀:去离子水为1:30-50;[0043]将上述所得的上清液3用去离子水透析72h，每4h换去离子水一次，透析结束后，获得粗多糖溶液；[0044]5、将步骤⑷所得的粗多糖溶液，控制温度为_40°C进行预冻3_5h，然后控制温度为-15°C-20°C进行第一次干燥20h，然后再控制温度为4°C进行第二次干燥5-10h，最终得到EPS。[0045]上述的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit作为发酵剂，通过常规方法制备嗜热链球菌发酵乳制品，特别是嗜热链球菌酸奶和嗜热链球菌奶酪。[0046]本发明的有益效果[0047]本发明的一种嗜热链球菌StreptococcusthermophiIusBenshit，在乳糖为碳源的条件下发酵，产EPS量最高可达160mgL，且EPS提取过程简单，可以实现大规模工业化应用。[0048]进一步，本发明的一种嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit，其作为发酵剂用于生产发酵乳制品，当作为发酵剂用于生产嗜热链球菌酸奶时，由于其产生的高产率的EPS能够显著改善嗜热链球菌酸奶的组织状态等质构特性，发酵所得的嗜热链球菌酸奶粘稠度好，使产品无需添加稳定剂，满足消费者对无添加剂的低脂酸奶的需求。附图说明[0049]图1、嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit在不同碳源下的生长曲线不意图；[0050]图2、嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit在不同碳源下的EPS产量示意图。具体实施方式[0051]下面通过具体的实施例并结合附图对本发明做进一步的描述，但并不限制本发明。[0052]下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法;所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0053]本发明各实施例中所用的：[0054]LMl7液体培养基:按每升计算，含胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，酵母浸出粉2.5g，牛肉膏5g，乳糖20g，β-磷酸甘油二钠五水化合物19g，七水硫酸镁0.58g，维生素C0.5g，余量为水;115°C灭菌20min;[0055]LMl7固体培养基，按每升计算，含胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，酵母浸出粉2.5g，牛肉膏5g，乳糖20g，β-磷酸甘油二钠五水化合物19g，七水硫酸镁0.58g，维生素C0.5g，琼脂粉20g，余量为水，115°C灭菌20min;[0056]GM17液体培养基:将LM17液体培养基中的乳糖替换为葡萄糖；[0057]GM17固体培养基:将LM17固体培养基中的乳糖替换为葡萄糖；[0058]GaIMl7液体培养基:将LMl7液体培养基中的乳糖替换为半乳糖；[0059]GalM17固体培养基:将LM17固体培养基中的乳糖替换为半乳糖。[0060]灭菌脱脂牛乳培养基:120gL的脱脂乳粉水溶液，115°C灭菌15min。[0061]本发明实施例中EPS的测定方法:采用苯酚硫酸法，具体见参考文献1。[0062]粗多糖溶液的测定方法:采用苯酚硫酸法，具体见参考文献2。[0063]实施例1[0064]嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit的培养方法，具体步骤如下：[0065]1、将保藏于脱脂牛乳培养基中的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit，按3%vv接种量接入灭菌脱脂牛乳培养基中，42°C静置培养IOh进行活化，得到活化好的嗜热链球菌StreptococcusthermophiIusBenshit;[0066]所述的保藏于脱脂牛乳培养基中的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit，按每升计算，含有嗜热链球菌StreptococcusthermophiIusBenshit的数量至少为l*101Qcfu;[0067]2、将步骤⑴所得的活化好的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit按3%vv接种量分别接入LM17、GM17和GalM17液体培养基中，37°C静置培养24h，分别得到对应于LMl7、GMl7和GaIMl7液体培养基的培养液。[0068]上述培养过程中每隔2h采用分光光度计在600nm测定培养液中的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit的浓度0D6。。，以嗜热链球菌StreptococcusthermophiIusBenshit的浓度0D6qq对培养时间作图得到嗜热链球菌Strept〇coccusthermophilusBenshit在LM17、GM17和GalM17中的生长曲线如图1所示，从图1中可以看出，嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit在LMl7液体培养基中生长迅速，在4h左右进入对数期，IOh左右进入稳定期，但是在GM17和GalM17液体培养基中生长缓慢，由此说明乳糖是热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit生长的最适碳源。[0069]实施例2[0070]利用嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit进行发酵生产EPS，具体步骤如下：[0071]1、将保藏于脱脂牛乳培养基中的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit，按3%接种量接入灭菌的LMl7固体培养基中，37°C静置培养24h进行活化，连续活化两代，得到活化好的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit;[0072]2、将步骤⑴所得的得到活化好的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit;按3%vv的接种量接种于装有LM17液体培养基的三角瓶中，37°C静置培养12h，得到种子液；[0073]3、发酵培养:将步骤2所得的种子液以3%vv的接种量分别接种于LM17、GM17和GalM17液体培养基中，在37°C条件下静置培养24h，得到对应于LM17、GM17和GalM17液体培养基的发酵液；[0074]4、将步骤3所得的对应于LM17、GM17和GalM17液体培养基发酵液分别控制温度为4°C、转速为8000g进行离心20min，分别收集所得的上清液la、lb、lc，分别沸水浴中IOmin后，分别在上清液la、lb、Ic中加入体积百分比浓度为80%wv的三氯乙酸水溶液至三氯乙酸的终浓度为4%wv，分别静置过夜，再次分别控制温度为4°C、转速为9000g进行离心20min，除去沉淀蛋白，分别收集所得的上清液2a、2b、2c;[0075]然后将上述所得的上清液2a、2b、2c分别用去离子水透析72h，每4h换去离子水一次，透析结束后，获得粗多糖溶液；[0076]分别取上述所得的粗多糖溶液，采用UV-1600PC型紫外可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司），用苯酚硫酸法[2]测定EPS含量，测定体系为ImL待测样品（所述的待测样品为上述透析后获得的粗多糖溶液），〇.5mL3%vv的苯酚水溶液和5mL浓硫酸，所得的对应于LM17、GM17和GalM17液体培养基的发酵液中的EPS含量示意图如图2所示，从图2中可以看出，嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit在碳源为乳糖时生长最好，EPS产量可达到160mgL;[0077]5、将步骤⑷所得的粗多糖溶液，控制温度为-40°C进行预冻3_5h，然后控制温度为-15°C-20°C进行第一次干燥20h，然后再控制温度为4°C进行第二次干燥5-10h，最终得到EPS。[0078]实施例3[0079]嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit发酵生产EPS，具体步骤如下：[0080]1、将保藏于脱脂牛乳培养基中的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit，按3%接种量接入灭菌的LMl7固体培养基中，37°C静置培养24h进行活化，连续活化两代，得到活化好的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit;[0081]2、将步骤⑴所得的得到活化好的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit;按3%vv的接种量接种于装有LM17液体培养基的三角瓶中，37°C静置培养12h，得到种子液；[0082]3、将步骤2所得的种子液以3%vv的接种量接种于LM17液体培养基中，在37°C条件下静置培养24h，得到发酵液；[0083]4、将步骤3所得的发酵液控制温度为4°C、转速为SOOOg进行离心20min、去沉淀以除去菌体和凝结蛋白，收集所得的上清液1;[0084]采用旋转浓缩的方法，控制温度为50°C，对上述所得的上清液1进行浓缩至原体积的13,得到浓缩液1，将所得的浓缩液1于沸水浴中IOmin以失活可降解多糖的酶后，然后在浓缩液1中加入体积百分比浓度为80%wv的三氯乙酸的水溶液至三氯乙酸终浓度为4%wv，静置过夜，再次控制温度为4°C、转速为9000g进行离心20min除去沉淀蛋白，收集所得的上清液2;[0085]采用旋转浓缩的方法，控制温度为50°C，对上述所得的上清液2进行浓缩至原体积的13,得到浓缩液2,在所得的浓缩液2中加入体积百分比浓度为95%vv的乙醇溶液至乙醇的终浓度为75%vv，4°C静置24h，控制温度为4°C、转速为8000g进行离心20min，收集所得的沉淀；[0086]将上述所得的沉淀用去离子水溶解，控制温度为4°C、转速为SOOOg进行离心20min去沉淀，收集所得的上清液3;[0087]上述沉淀和去离子水的用量，按重量比计算，沉淀:去离子水为1:30-50;[0088]将上述所得的上清液3用去离子水透析72h，每4h换去离子水一次，透析结束后，获得粗多糖溶液；[0089]5、将步骤⑷所得的粗多糖溶液，控制温度为_40°C进行预冻3_5h，然后控制温度为-15°C-20°C进行第一次干燥20h，然后再控制温度为4°C进行第二次干燥5-10h，最终得到EPS。[0090]实施例4[0091]嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit作为发酵剂用于制备嗜热链球菌酸奶的方法，具体步骤如下：[0092]1、将保藏于脱脂牛乳培养基中的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit，按3%vv接种量接入灭菌脱脂牛乳培养基中，42°C静置培养IOh进行活化，得到活化好的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit;[0093]所述的保藏于脱脂牛乳培养基中的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit，按每升计算，含有嗜热链球菌StreptococcusthermophiIusBenshit的数量至少为l*101Qcfu;[0094]2、将步骤⑴所得的得到活化好的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit;按3-5%vv的接种量接种于装有新鲜牛乳的三角瓶中，40-42°C静置培养至牛乳凝固，然后控制温度4°C进行后熟16h，得到嗜热链球菌酸奶。[0095]上述所得的嗜热链球菌酸奶质地粘稠，极少乳清析出，口感好。采用乌氏粘度计测定的酸奶粘度为457〇1^3«8，酸奶持水力为50.8%。[0096]综上所述，本发明的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit，在乳糖为碳源时生长最好，EPS产量最高可达160mgL，该嗜热链球菌作为酸奶发酵剂，显著提高了酸奶粘度，酸奶粘度可达4570mPa·s，改善了酸奶的组织状态，酸奶持水力为50.8%，从而使发酵所得的酸奶具有良好的风味[0097]以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。

权利要求：1.一种嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit,保藏编号为CGMCCNo.12098。2.如权利要求1所述的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit作为发酵剂用于生产EPS或用于生产嗜热链球菌发酵乳制品。3.如权利要求2所述的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit作为发酵剂用于生产EPS的方法，其特征在于具体包括如下步骤：1、将保藏于脱脂牛乳培养基中的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit，按3%vv接种量接入灭菌脱脂牛乳培养基中，42°C静置培养IOh进行活化，得到活化好的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit;所述的保藏于脱脂牛乳培养基中的嗜热链球菌StreptococcusthermophiIusBenshit，按每升计算，含有嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit的数量至少为l*101Qcfu;2、将活化好的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit按3%vv接种量接入LMl7液体培养基中，37°C静置培养12-24h，得到种子液；3、发酵培养将步骤2所得的种子液以3%vv的接种量接种于LM17液体培养基中，在37°C条件下静置培养24h，得到发酵液；4、将步骤3所得的发酵液控制温度为4°C、转速为SOOOg进行离心20min，收集所得的上清液1;采用旋转浓缩的方法，控制温度为50°C，对上述所得的上清液1进行浓缩至原体积的13,得到浓缩液1;将所得的浓缩液1于沸水浴中IOmin后在浓缩液1中加入体积百分比浓度为80%wv的三氯乙酸的水溶液至三氯乙酸终浓度为4%wv，静置过夜，然后再控制温度为4°C、转速为9000g进行离心20min，收集所得的上清液2;采用旋转浓缩的方法，控制温度为50°C，对上述所得的上清液2进行浓缩至原体积的13,得到浓缩液2;在所得的浓缩液2中加入体积百分比浓度为95%vv的乙醇溶液至乙醇的终浓度为75%vv，4°C静置24h，控制温度为4°C、转速为8000g进行离心20min，收集所得的沉淀；将上述所得的沉淀用去离子水溶解，控制温度为4°C、转速为SOOOg进行离心20min去沉淀，收集所得的上清液3;上述沉淀和去离子水的用量，按重量比计算，沉淀:去离子水为1:30-50;将上述所得的上清液3用去离子水透析72h，每4h换去离子水一次，透析结束后，获得粗多糖溶液；5、将步骤4所得的粗多糖溶液，控制温度为-40°C进行预冻3-5h，然后控制温度为-15°C-20°C进行第一次干燥20h，然后再控制温度为4°C进行第二次干燥5-10h，最终得到EPS。4.如权利要求3所述的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit作为发酵剂用于生产EPS的方法，其特征在于步骤（1中所述的灭菌脱脂牛乳培养基：120gL的脱脂乳粉水溶液，115°C灭菌15min;步骤⑵、步骤⑶中所述的LM17液体培养基:按每升计算，含胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，酵母浸出粉2.5g，牛肉膏5g，乳糖2〇g，0-磷酸甘油二钠五水化合物19g，七水硫酸镁0.58g，维生素C0.5g，余量为水;使用时，115°C灭菌20min。5.如权利要求2所述的嗜热链球菌StreptococcusthermophiIusBenshit作为发酵剂用于生产嗜热链球菌发酵乳制品，所述的嗜热链球菌发酵乳制品为嗜热链球菌酸奶或嗜热链球菌奶酪。6.如权利要求5所述的嗜热链球菌StreptococcusthermophiIusBenshit作为发酵剂用于制备嗜热链球菌酸奶的方法，其特征在于具体步骤如下：1、将保藏于脱脂牛乳培养基中的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit，按3%vv接种量接入灭菌脱脂牛乳培养基中，42°C静置培养IOh进行活化，得到活化好的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit;所述的保藏于脱脂牛乳培养基中的嗜热链球菌StreptococcusthermophiIusBenshit，按每升计算，含有嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit的数量至少为l*101Qcfu;2、将步骤⑴所得的得到活化好的嗜热链球菌StreptococcusthermophilusBenshit;按3-5%vv的接种量接种于装有新鲜牛乳的三角瓶中，40-42°C静置培养至牛乳凝固，然后控制温度4°C进行后熟16h，得到嗜热链球菌酸奶。

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