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申请/专利权人：中国人民解放军第二军医大学

摘要：本发明涉及生物技术领域，具体是snoRA7A的新用途，以及一种在体外培养条件下增强hUCMSCs增殖能力的方法。本发明成功构建snoRA7A的表达质粒，将该质粒转染hUCMSCs，获得snoRA7A高表达的hUCMSCs，较hUCMSCs具有更高的增殖能力，且多能性更好；可在体外培养条件下，获取大量功能状态较好的细胞，解决了hUCMSCs在体外培养过程中随着传代次数增加，增殖能力等生物活性降低的问题；本发明为hUCMSCs体外培养传代过程中细胞增殖能力的维持以及增强提供了新思路，为hUCMSCs的临床应用提供了更广阔的前景。

主权项：snoRA7A在制备hUCMSCs体外培养试剂中的应用。

全文数据：一种增强hUCMSCs增殖能力的方法及其应用技术领域本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种增强hUCMSCs增殖能力的方法及其应用。背景技术间充质干细胞mesenchymalstemcells,MSCs是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSCs具有自我复制、大量增殖、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性。现阶段主要从脂肪、骨髓、脐带、脐血组织中提取MSCs。人脐带间充质干细胞humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUCMSCs，是存在于脐带中的一种MSCs，其具有取材方便，易于采集和运输，生物学特性稳定，免疫原性低，无异体排斥反应，避免了伦理争议，细胞数量多等优点。hUCMSCs在临床疾病研究应用中有着重要意义，如能通过相应的诱导将hUCMSCs分化为我们需要的细胞，移植于病变部位促进病变的愈合。hUCMSCs生物学特征及研究进展：间充质干细胞是一类具有自我更新增殖和多向分化潜能的干细胞，在1966年首先由friedenstein等从骨髓中发现。da.liang研究发现，间充质干细胞具有向内中外三个胚层包括肌腱、韧带、干细胞、心肌细胞和骨髓基质细胞等分化发育的潜能。而成人骨髓源间充质干细胞数量级增殖分化潜能随年龄的增大而下降，且供者间充质干细胞的采集须行骨髓穿刺，由于疾病的原因，患者常患有感染、体质较弱等因素也限制了自体骨髓间充质干细胞的应用。因此，寻找新的间充质干细胞来源是目前国内外干细胞研究的热点，hUCMSCs具有来源丰富、对供者无影响。易于采集和运输。无一体排斥反应、避免伦理争执等诸多优点，因此，hUCMSCs有望成为骨髓间充质干细胞的理想替代来源。hUCMSCs与骨髓间充质干细胞一样是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。理论上，在一定条件下，hUCMSCs可以定向分化成机体内的各种功能细胞，形成任何类型的组织以及器官，具有“可塑性”。并且，与骨髓间充质干细胞相比，hUCMSCs具有诸多优点而成为近年来医学界的研究热点。小核仁RNAsmallnucleolusRNAs，snoRNAs是一类发现较早且位于核仁内的小非编码RNA，在核糖体RNAribosomalRNA,rRNA、信使RNAmessengerRNA，mRNA、小核RNAsmallnuclearRNA，snRNA的成熟及修饰中均发挥重要作用。snoRNAs的功能及其作用途径一直以来均是学术界的研究热点。目前，snoRNAs对rRNA的化学修饰作用已得到广泛认可。另外，有研究表明snoRNAs与一些遗传疾病以及肿瘤性疾病的发生发展存在密切关联。随着研究的深入，snoRNA在调控细胞增殖方面的作用越来越受到大家重视。研究发现，部分snoRNA对细胞的增殖具有调控作用，参见文献：Pacilli,A.,Ceccarelli,C.,Trere,D.,&Montanaro,L..SnoRNAU50levelsareregulatedbycellproliferationandrRNAtranscription.IntJMolSci,2013，147：14923-14935.目前尚无有关snoRA7A维持并增强hUCMSCs增殖能力的研究及应用。发明内容本发明的目的在于提供snoRA7A的新用途，本发明的另一目的在于提供利用snoRA7A来维持和或增强hUCMSCs增殖能力的应用。为了实现上述目的，申请人构建了含目的基因snoRA7A的过表达质粒载体将其转染hUCMSCs，以获得snoRA7A高表达，称之为snoRA7Aoe-hUCMSCs。通过CCK8测量各组细胞的增殖速度。本发明的主要技术方案如下：首先是根据snoRA7A的基因结构，设计引物，以hUCMSCs总DNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备snoRA7AcDNA，再构建pLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A表达载体用于转染hUCMSCs。本发明的第一方面，提供snoRA7A的新用途。本发明提供了snoRA7A在体外培养条件下维持和或增强hUCMSCs增殖能力的应用，也即snoRA7A在制备hUCMSCs体外培养试剂中的应用。所述的snoRA7A，其具体序列为：GACCTCCTGGGATCGCATCTGGAGAGTGCCTAGTATTCTGCCAGCTTCGGAAAGGGAGGGAAAGCAAGCCTGGCAGAGGCACCCATTCCATTCCCAGCTTGCTCCGTAGCTGGCGATTGGAAGACACTCTGCGACAGTGSEQIDNO:1所述的试剂，用于维持和或增强hUCMSCs增殖活性，并有助于其干性的维持。本发明所述的维持和或增强hUCMSCs增殖活性，是指hUCMSCs在体外培养条件下，随着传代次数增加，可减缓细胞增殖能力的降低，细胞倍增时间以及细胞活性不会降低，即hUCMSCs增殖能力不会降低。本发明所述的hUCMSCs通过机械法结合酶消化法的方式获得原代细胞或传代细胞。本发明的第二方面，提供了一种利用snoRA7A来维持和或增强hUCMSCs体外培养条件下增殖能力的方法，该方法包括以下步骤：A、构建snoRA7A的重组质粒；B、将步骤A获得的重组质粒转染hUCMSCs，获得snoRA7A高表达的hUCMSCs。所述的步骤A构建的重组质粒为：pLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A表达载体。所述的重组人pLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A表达载体，转染hUCMSCs，获得snoRA7A高表达的hUCMSCs，称之为snoRA7Aoe-hUCMSCs。所述的步骤A具体为：首先根据snoRA7A的基因序列如SEQIDNO:1，以及所选载体pLKD-CMV-G&PR-U6，分别选取AgeI、BamHI为酶切位点设计上下游引物，以hUCMSCs总DNA为模板，通过RT-PCR获取含酶切位点序列的目的片段。分别酶切目的片段和载体，再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的pLKD载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落先进行PCR鉴定，PCR鉴定阳性菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的pLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A真核表达载体。步骤A中获取目的片段所用引物序列为：snoRA7AAgeIF:5'CATTCCCAGCTTGCTCCGTA3'SEQIDNO:2snoRA7ABamHIR:5'GGGATCCCGCACTGTCG3'SEQIDNO:3其中真核表达载体的构建方法为常规方法，可参见工具书著[美]J.莎姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》，科学出版社。所述的步骤B中转染步骤如下：按fugene6微升：质粒微克＝4:3的比例对生长至60％～70％融合的细胞进行转染，24小时后更换新的培养基，获得snoRA7Aoe-hUCMSCs。在本发明一个更优选实施例中，转染步骤具体为：取97ulDMEM到1mlOD管中，加入3μg过表达质粒到DMEM中，用加样枪混匀或拿手指轻轻弹动，之后室温放置5分钟。同时4μlfugene6到预混的DMEM中，轻轻混匀，静置15分钟。15分钟后用100ul枪吸出反应液，均匀的滴入6孔板中，轻轻拍打。放入培养箱。24小时后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基，获得snoRA7Aoe-hUCMSCs。本发明的第三方面，提供了上述方法获得的snoRA7Aoe-hUCMSCs，即snoRA7A高表达的hUCMSCs。继续培养，观察snoRA7Aoe-hUCMSCs的生长状态，以及是否维持成纤维样生长状态，细胞增殖所需时间。实验重复三次，均可发现snoRA7Aoe-hUCMSCs同对照组用载体pLKD-CON转染的毛乳头细胞：CON-hUCMSCs相比可更好的维持成纤维样，细胞增殖快。本发明优点在于：本发明成功构建了snoRA7A高表达的hUCMSCs，较hUCMSCs具有更高的增殖能力，且多能性更好；可在体外培养条件下，获取大量功能状态较好的细胞，解决了hUCMSCs在体外培养过程中随着传代次数增加，增殖能力等生物活性降低的问题；本发明为hUCMSCs体外培养传代过程中细胞增殖能力的维持以及增强提供了新思路，为hUCMSCs的临床应用提供了更广阔的前景。附图说明图1为分离培养的hUCMSCs；其中A为snoRA7A高表达的第3代hUCMSCs，B为snoRA7A高表达的第5代hUCMSCs，C为snoRA7A高表达的第7代hUCMSCs，D为snoRA7A高表达的第9代hUCMSCs，E为空载体转染的第3代hUCMSCs，F为空载体转染的第5代hUCMSCs，G为空载体转染的第7代hUCMSCs，H为空载体转染的第9代。可见snoRA7Aoe-hUCMSCs成纤维样生长状态维持较空白组好，且培养相同时间后细胞密度较空白组高。图2为实时PCR的检测结果，表明在第3代hUCMSCs中，snoRA7A表达量增加在snoRA7Aoe-hUCMSCs中较CON-hUCMSCs显著增加。提示转染效率高。图3是过表达snoRA7A及其对照组的第3代hUCMSCs经传代后细胞总体活性的变化，染色越深OD值越高，表示活细胞数越多。由于各组细胞起始数相同，因此，OD值可用于指示细胞增殖能力。由图3可知，过表达snoRA7A后细胞OD值较对照组高，且呈逐渐增长趋势，表明过表达snoRA7A后hUCMSCs增殖活性增强。图4是过表达snoRA7A及其对照组的第3代hUCMSCs经传代后细胞倍增时间的变化。由图看以看出，过表达snoRA7A后hUCMSCs细胞倍增时间明显缩短，细胞增殖加快。具体实施方式下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例1：构建真核表达载体pLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A，感染hUCMSCsHUCMSCS。1、hUCMSCs分离培养人脐带来自长海医院妇产科。原代培养得到hUCMSCs。因随传代次数增加，hUCMSCs的形态及增殖速率会发生变化，为保证实验的准确性和可靠性，我们所有的体外实验均选择第2代hUCMSCs为研究对象。2、制备人基因组DNA用Promega的基因组DNA纯化试剂盒，方法如下：[1].收集hUCMSCs至一干净的1.5mlOD管中；[2].加入600微升核裂解液，用移液枪反复吹打以裂解组织，直到可见的组织块消失，65℃静置20min；[3].加入3微升RNA酶，颠倒2-5次，37℃30min，然后冷却至室温。[4].加入200微升蛋白沉淀液并使用涡旋振荡器高速剧烈振荡20sec，转移至冰上冷却5min；[5].室温12000rpm离心4min，形成白色致密的蛋白沉淀；[6].小心移取上清含DNA至一干净的1.5毫升OD管中，加入600微升异丙醇，移取上清的时候勿碰到沉淀；[7].轻轻上下颠倒混匀溶液，直至白色线状DNA形成块状沉淀；[8].室温12000rpm离心5min，此时可见白色DNA沉淀，小心弃去上清；[9].加入600微升70％乙醇，轻轻颠倒OD管数次清洗DNA沉淀，室温12000rpm离心2min；[10].小心弃去上清，并将OD管倒置于干净的吸水纸上，自然干燥10至15min；[11].加入100微升ddH2O，60℃烘箱中孵育1小时以溶解DNA；[12].DNA样品保存于-20℃冰箱。3、合成引物及构建pLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A真核表达载体1设计引物snoRA7AAgeIF:5'CATTCCCAGCTTGCTCCGTA3'SEQIDNO:2snoRA7ABamHIR:5'GGGATCCCGCACTGTCG3'SEQIDNO:3酶切位点为AgeI和BamHI，分别加入引物的5’端，并加入酶切位点的保护碱基。2PCR扩增目的片段在200μlEP管中配制以下体系，基因组DNA模板原液稀释20倍后取0.5μL扩增snoRA7A：取5μlPCR产物，做1％琼脂糖凝胶电泳含EB0.5μgml；电压：80V鉴定；其余用于回收、纯化目的片段。3回收纯化目的片段PCR产物经1％凝胶电泳后，在紫外灯下，用切胶刀片切取含目的基因片段的凝胶于干净1.5mlOD管中，称重后，按用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.3.0做胶回收。4线性化表达载体的制备：用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10×反应Buffer5μL，限制性内切酶各1μL，用水补足50μL，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.3.0做胶回收。5目的基因构建入线性化表达载体中：方法：使用无缝克隆试剂盒单个目的基因插入片段适用将目的基因片段和线性化载体以摩尔比2:1加到离心管中进行重组反应：最适插入片段使用量＝[0.04×插入片段碱基数]ng0.03pmol最适线性化载体使用量＝[0.02×线性化载体碱基数]ng0.03pmol6重组质粒的鉴定及保存用上述重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，扩增细菌并测序，测序正确如SEQIDNO:1所示。转化步骤如下：用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加10μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的EP管架上，恰恰放置90秒，不要摇动EP管架。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l-2分钟。每管加800μlLB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏。将150μl已转化的感受态细胞转移到氨苄抗性100ugml的LB琼脂培养基上。将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿，于37℃培养，16小时。长出的克隆进行后续PCR鉴定。4、pLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A感染hUCMSCs。实验前保证细胞的良好生长状态，实验前一天接种1×104个目的细胞于6孔培养板中，所加培养基体积为0.5ml。待细胞生长至60-70％时准备进行pLKD-CMV-G&PR-U6-snoRA7A和pLKD-CMV-G&PR-U6-CON转染。转染步骤如下：取97ulDMEM到1mlOD管中，加入3μg过表达质粒到DMEM中，用加样枪混匀或拿手指轻轻弹动，之后室温放置5分钟。同时4μlfugene6到预混的DMEM中，轻轻混匀，静置15分钟。15分钟后用100ul枪吸出反应液，均匀的滴入6孔板中，轻轻拍打。分别标记为snoRA7Aoe-hUCMSCs和CON-hUCMSCs对照组。放入培养箱。培养过夜后，第二天早上换正常培养基。采用上述方法获得的snoRA7Aoe-hUCMSCs，即snoRA7A高表达的hUCMSCs。实施例2：细胞实验利用荧光显微镜拍照CCK8细胞倍增时间等生物学实验方法分析细胞形态变化以及细胞增殖能力的变化。具体方法如下：1细胞生长状态的比较用倒置显微镜观察感染的相同代数snoRA7Aoe-hUCMSCs，对照组CON-hUCMSCs，snoRA7Aoe-hUCMSCs可更好的维持成纤维样生长形态，且传代相同时间后细胞密度更高。如图1所示。2实时定量PCRReal-timePCR检测转染后snoRA7A的表达情况①抽提转染后不同时间点总DNA，逆转录为cDNA。②设计引物，检测snoRA7A的表达水平。GAPDH作为检测用内参。引物序列如下：GAPDH的Real-timePCR引物：P1:5'-CTTGGGCTACACTGAGGACC-3'SEQIDNO:4P2:5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGAC-3'SEQIDNO:5。PCR产物：300bp。退火温度：58℃snoRA7A的Real-timePCR引物如下：P1:TTCGGAAAGGGAGGGAAAGCSEQIDNO:6P2:AGCTGGGAATGGAATGGGTGSEQIDNO:7。PCR产物：137bp。退火温度：58℃体系如下：PCR反应步骤：PCR产物含量计算采用比较Ct值法进行相对定量。比较Ct值法前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到Ct值来反应起始模板的量，一个循环Ct＝1的不同相当于起始模板数2倍的差异。定义：ΔCt＝Ct目的基因-Ct内标ΔΔCt＝Ct目的基因-Ct内标已处理-Ct目的基因-Ct内标未处理RQ＝2-ΔΔCt利用EXCEL里面的统计分析工具，计算各组的平均值和标准差，两组之间用T检验，P0.05认为有统计学意义，P0.01认为差异显著。将第3天、5天和7天分别和第1天进行比较，进行T检验分析。可见snoRA7Aoe-hUCMSCs较CON-hUCMSCs，snoRA7A的表达量增加，如图2所示。3CCK8检测细胞增殖活性将转染后稳定生长的两组第3代细胞snoRA7Aoe-hUCMSCs和CON-hUCMSCs分别传代至96孔板中，每组传20孔，每孔100个细胞，待细胞贴壁并稳定生长后更换培养基含10％CCK8的培养基，每组更换4孔，室温下孵育3h后于540nm波长下进行OD值测量。每8小时测定一次，共测定5个时间点。计算每个时间点每组细胞的平均OD值，以此绘制细胞活性折线图见图3。4hUCMSCs细胞倍增时间检测取转染后稳定增长的两组第3代细胞snoRA7Aoe-hUCMSCs和CON-hUCMSCs分别传代至6孔板中，每组传3孔，每孔1×104个细胞，待其中一组细胞增长至80％后记录细胞生长时间T，并将所有细胞分别消化为单细胞，进行细胞计数N。其中，细胞倍增次数为C，细胞倍增时间为t。2C＝N1×104t＝TC由上述公式计算并获得每孔细胞的倍增时间，计算同组细胞的平均倍增时间并绘制折线图见图4。以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

权利要求：1.snoRA7A在制备hUCMSCs体外培养试剂中的应用；所述的试剂在体外培养条件下增强hUCMSCs的增殖能力；所述的snoRA7A的序列如SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述的snoRA7A在制备hUCMSCs体外培养试剂中的应用，其特征在于，所述的试剂使hUCMSCs在体外培养条件下，随着传代次数增加，减缓hUCMSCs增殖能力的降低。3.一种在体外培养条件下增强hUCMSCs增殖能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、构建snoRA7A的重组质粒；所述的snoRA7A的序列如SEQIDNO:1所示；B、用步骤A获得的重组质粒转染hUCMSCs，获得snoRA7A高表达的hUCMSCs。4.根据权利要求3所述的在体外培养条件下增强hUCMSCs增殖能力的方法，其特征在于，所述的步骤A构建的重组质粒为pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA-snoRA7A真核表达载体。5.根据权利要求4所述的在体外培养条件下增强hUCMSCs增殖能力的方法，其特征在于，所述的步骤A为：首先根据snoRA7A的基因序列，设计引物，以hUCMSCs的总DNA为模板，通过RT-PCR调取目的片段，再构建重组pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA-snoRA7A真核表达载体。6.根据权利要求3所述的在体外培养条件下增强hUCMSCs增殖能力的方法，其特征在于，所述的步骤B中转染的步骤为：按fugene6：质粒=4:3的微升微克比例对生长至60-70%融合的细胞进行转染，24小时后更换新的培养基。7.一种snoRA7A高表达的hUCMSCs，其特征在于，所述的snoRA7A高表达的hUCMSCs采用权利要求3-6任一所述的方法制备得到。

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