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申请/专利权人：上海交通大学医学院附属瑞金医院

摘要：本发明公开了一种Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用；设计针对斑马鱼cebpa基因的TALEN序列；构建其左右臂质粒，并体外转录出相应的mRNA；将TALEN左右臂mRNA混合并显微注射到斑马鱼受精卵中；注射后的胚胎养至F0成鱼与野生型成鱼交配，将携带有cebpa基因突变的胚胎养至F1成鱼；含有cebpa基因突变的F1成鱼再与野生型成鱼交配，产生的胚胎养至F2成鱼，通过剪鱼尾鳍抽提基因组DNA的方法鉴定，确定所述突变体。本发明通过TALEN基因编辑技术，能够快速高效的建立cebpa基因缺失斑马鱼品系，利用该模型能够开展针对治疗白血病，肝脏发育不良以及粒细胞缺失等疾病的药物筛选工作。

主权项：一种Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、设计针对斑马鱼cebpa基因的TALEN序列；S2、构建TALEN的左、右臂质粒，并分别体外转录出TALEN左、右臂mRNA；S3、将TALEN左、右臂mRNA混合并显微注射到斑马鱼受精卵中；S4、将注射后的胚胎养至F0成鱼，并与野生型成鱼交配，对产生的胚胎进行限制性内切酶方法以及DNA测序方法鉴定，将携带有cebpa基因突变的胚胎养至F1成鱼；S5、对F1成鱼进行剪鱼尾鳍抽提基因组DNA方法鉴定是否存在cebpa基因突变，并通过DNA测序方法确定其cebpa基因突变类型，将含有cebpa基因突变的F1成鱼再次与野生型成鱼交配，产生的胚胎养至F2成鱼；S6、对F2成鱼通过剪鱼尾鳍抽提基因组DNA的方法鉴定，确定突变鱼系，该突变鱼系即所述Cebpa基因缺失斑马鱼突变体。

全文数据：Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用技术领域[0001]本发明属于基因编辑技术领域，涉及一种由TALEN介导的Cebpa基因缺失型斑马鱼突变体的制备及其应用。背景技术[0002]CCAAT增强子结合蛋白aCCAATenhancer-bindingproteina，CEBPa是CEBPs转录因子家族中的重要成员，由单一外显子编码，其C端具有高度保守的DNA结合结构域和二聚化功能域basicregionandleucinezipperdomain，bZIP。研究发现，CEBPa在造血发育，肝脏发育以及脂肪细胞分化等过程中发挥着重要作用，其功能异常更是与多种疾病的发生及发展密切相关。在急性髓系白血病患者中，CEBPa基因突变率大约为5%-14%。[0003]斑马鱼作为一种新兴的模式生物，兼具了“小模式生物”（如酵母，线虫，果蝇）和“大模式生物”（如小鼠）的众多优势:斑马鱼成鱼体长3-4cm，易于实验室大规模词养;一次交配可产数百枚胚胎，方便进行大规模的化学诱变剂突变筛选及活体高通量药物筛选;从受精卵发育到性成熟个体时间短，仅需2-3个月时间；斑马鱼体外受精，胚胎体外发育，早期透明，易于实时观测和操作;二倍体生物，斑马鱼基因组测序工作已经完成，其许多信号通路及重要基因都与人类高度保守，并且其神经系统，免疫系统，心血管系统，生殖系统等的发育和功能也与人类有许多的共同点，可以作为研究人类发育和疾病的动物模型。此外，随着研宄的深入，许多研究手段和方法也都日趋成熟。由此可见，斑马鱼是一种非常理想的研究脊椎动物遗传和发育的模式生物。[0004]TALETranscriptionActivator-LikeEffector是由植物病原体黄单胞菌Xanthomonas分泌的一类具有转录激活功能的蛋白，该蛋白由一些非常保守的重复氨基酸序列模块组成，每个模块一般包含33-35个氨基酸，其中第12,13位氨基酸种类可变且决定了TALE与DNA结合的特异性。通过将TALE与限制性内切酶FokI融合便形成了一类具有特异性基因组编辑功能的强大工具-TALENtranscriptionactivator-1ikeeffectornucleases。在细胞内TALEN与基因组的靶位点结合，并当FokI形成二聚体后便发挥内切酶活性对DNA双链进行切割，从而造成DNA双链损伤。当DNA损伤后，机体会启动两种修复机制，一种为非同源性末端接合机制Non-homologousEndJoining，NHEJ，另一种为同源重组修复机制homologousrecombination。在没有外源的同源序列加入时，细胞便会启动NHEJ修复机制，将断裂的DNA末端重新连接在一起。但是，这种修复机制是一种快速的，非精确的修复，极易发生错误缺失插入），从而造成移码突变，因而最终可以达到基因敲除的目的。作为一种新兴的基因组编辑技术，TALEN系统具有操作简单，时间短，成本低等优势。[0005]CRISPRCas技术作为另一种基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。虽然CRISPRCas技术在靶位点设计上更灵活，简便，但是其特异不高，脱靶率远高于TALEN技术，并且其基因打靶效率也低于TALEN技术。发明内容[0006]本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种由TALEN介导的Cebpa基因缺失型斑马鱼突变体的制备及其应用。cebpa基因与多种疾病的发生及发展密切相关，此模型的建立将具有很好的医学研宄价值和商业应用价值。[0007]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：[0008]本发明涉及一种Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：[0009]S1、设计针对斑马鱼cebpa基因的TALEN序列；[0010]S2、构建TALEN的左、右臂质粒，并分别体外转录出TALEN左、右臂mRNA;[0011]S3、将TALEN左、右臂mRNA混合并显微注射到斑马鱼受精卵中；[0012]S4、将注射后的胚胎养至F0成鱼，并与野生型成鱼交配，对产生的胚胎进行限制性内切酶方法以及DNA测序方法鉴定，将携带有cebpa基因突变的胚胎养至F1成鱼；[0013]S5、对F1成鱼进行剪鱼尾鳍抽提基因组DNA方法鉴定是否存在cebpa基因突变，并通过DNA测序方法确定其cebpa基因突变类型，将含有cebpa基因突变的F1成鱼再次与野生型成鱼交配，产生的胚胎养至F2成鱼；[0014]S6、对F2成鱼通过剪鱼尾鳍抽提基因组DNA的方法鉴定，确定突变鱼系，该突变鱼系即所述Cebpa基因缺失斑马鱼突变体。[0015]优选的，步骤S1中，TALEN序列的左臂序列如SEQIDNO.1所示，TALEN序列的右臂序列如SEQIDN0.2所示。[0016]优选的，步骤S2中还包括注射后待胚胎发育至2-3天，挑选若干枚正常发育的胚胎，抽提基因组DNA，并对cebpa基因进行PCR扩增，PCR扩增产物通过限制性内切酶的方法鉴定TALEN是否有效的步骤。[0017]优选的，对cebpa基因进行PCR扩增采用的引物序列如SEQIDN0.3、SEQIDN0.4所示。[0018]优选的，步骤Se中还包括克隆斑马鱼cebpa突变基因至pCS2+表达载体中，通过突光素酶报告实验luciferaseassay检测该突变Cebpa是否还具有转录活性功能的步骤。[0019]优选的，步骤S6中还包括将F2代cebpa突变体自交产生的胚胎养至4-6天，利用苏丹黑染色的方法检测cebpa基因敲除胚胎的粒细胞发育情况的步骤。[0020]本发明还涉及一种根据所述的Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法建立的cebpa基因缺失斑马鱼模型在作为针对治疗白血病，肝脏发育不良以及粒细胞缺失疾病的药物筛选模型中的用途。[0021]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：[0022]1、本发明通过TALEN基因编辑技术，能够快速，高效的建立cebpa基因缺失斑马鱼品系。CRISPRCas技术基因打靶效率略低于TALEN技术，并且脱靶率高于TALEN技术，而本发明创新性地结合使用TALEN技术能够更有效的敲除由单一外显子编码的cebpa基因。cebpa基因与多种疾病的发生及发展密切相关，在此模型基础上能够深入开展相关疾病的研究，如白血病，肝癌等，从而具有很好的医学研究价值。[0023]2、利用本发明建立的模型能够开展针对治疗白血病，肝脏发育不良以及粒细胞缺失等疾病的药物筛选工作，从而具备非常有前景的商业应用价值。附图说明[0024]图1为本发明的斑马鱼cebpa基因及TALEN祀位点示意图；其中，下划线碱基分别为TALEN左臂和右臂序列，加粗碱基为限制性内切酶San酶切位点；[0025]图2为电泳检测结果示意图；[0026]图3为测序结果示意图；[0027]图4为苏丹黑染色结果示意图。具体实施方式[0028]下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。[0029]实施例[0030]1、TALEN基因敲除靶位点设计[0031]在http:asia•ensembl•orgindex.html网站查询斑马鱼cebpa基因的基因组DNA序列。根据TALEN设计原理，在https:tale-nt.cac•Cornell•edu网站设计针对斑马鱼cebpa基因的TALEN序列。设计的TALEN左右臂序列分别为TALI:TCGAGGGAAATCCAAGSEQIDN0.1；TAL2：TGTACTCGGTGCTGTTSEQIDN0.2〇[0032]2、TALEN左右臂mRNA体外转录[0033]利用体外转录试剂盒分别转录合成TALEN左右臂mRNA。[0034]3、斑马鱼胚胎的显微注射及靶点有效性测定[0035]将TALEN左右臂mRNA混合终浓度分别为150ngul，在受精卵一细胞期进行显微注射，注射量为2nl。注射后待胚胎发育至48小时，挑选5枚正常发育的胚胎，抽提基因组DNA，并对cebpa基因进行PCR扩增。引物分别为cebpa-Forward:ATGGAGCAAGCAAACCTCTACGAGGSEQIDNO.3；cebpa-Reverse：TTAAGCGCAGTTGCCCATGGCTTTGSEQIDN0.4。反应条件为：预变性94°C25min;变性94°C30s，退火58°C30s，延伸72°Clmin，扩增35个循环;72°ClOmin。取10ulPCR产物进行SalI酶切2小时，电泳检测TALEN祀位点的有效性，并对PCR产物测序分析。[0036]图1为本发明的斑马鱼cebpa基因及TALEN靶位点；下划线碱基分别为TALEN左臂和右臂序列。红色碱基为限制性内切酶Sail酶切位点。[0037]4、cebpa基因敲除初建者R的制备[0038]按照步骤3的方法对斑马鱼受精卵进行显微注射，发育60天后分别对幼鱼进行剪取尾鳍，制备基因组DNA模板，按照步骤3的方法对R进行鉴定，确定初建者R。[0039]5、F1突变体筛选[0040]收取F0与野生型斑马鱼交配产生的胚胎养至成鱼即F1，分别剪取尾鳍进行基因组型鉴定，筛选得到能够遗传的cebpa突变体F1R。[OO41]对建立的F1杂合子提取基因组DNA，利用突变检测引物cebpa-Forwrd和cebpa-Reverse进行PCR扩增，并对PCR产物进行SalI酶切鉴定，如图2，结果显示TALEN系统能够有效的在基因组水平破坏cebpa基因。[0042]对建立的F1杂合子提取基因组DNA，利用突变检测引物cebpa-Forwrd和cebpa-Reverse进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，如图3,结果显示TALEN系统导致目的基因cebpa外显子1缺失了两个碱基，从而导致移码突变的产生，破坏了Cebpa蛋白C端的bZIP结构域。[0043]6、F2突变体筛选[0044]收取F1突变体与野生型斑马鱼交配产生的胚胎养至成鱼即F2,分别剪取尾鳍进行基因组型鉴定，筛选得到能够稳定遗传的cebpa突变体F2代。[0045]7、苏丹黑染色检测cebpa缺失后粒细胞发育情况[0046]将F2代的cebpa突变体自交产生的胚胎养至5天，并用4%多聚甲醛室温固定2小时后，进行苏丹黑染色检测cebpa缺失纯合子中粒细胞发育情况。对建立的F2杂合子自交，产生的胚胎发育到第五天进行苏丹黑染色的结果如图4,结果显示在cebpa敲除的纯合子胚胎中粒细胞缺失。

权利要求：1.一种Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：51、设计针对斑马鱼cebpa基因的TALEN序列；52、构建TALEN的左、右臂质粒，并分别体外转录出TALEN左、右臂mRNA;53、将TALEN左、右臂mRNA混合并显微注射到斑马鱼受精卵中；54、将注射后的胚胎养至H成鱼，并与野生型成鱼交配，对产生的胚胎进行限制性内切酶方法以及DNA测序方法鉴定，将携带有cebpa基因突变的胚胎养至F1成鱼；55、对F1成鱼进行剪鱼尾鳍抽提基因组DNA方法鉴定是否存在cebpa基因突变，并通过DNA测序方法确定其cebpa基因突变类型，将含有cebpa基因突变的F1成鱼再次与野生型成鱼交配，产生的胚胎养至F2成鱼；56、对F2成鱼通过剪鱼尾鳍抽提基因组DNA的方法鉴定，确定突变鱼系，该突变鱼系即所述Cebpa基因缺失斑马鱼突变体。2.根据权利要求1所述的Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，TALEN序列的左臂序列如SEQIDN0.1所示，TALEN序列的右臂序列如SEQIDN0.2所」、〇3.根据权利要求1所述的Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤S2中还包括注射后待胚胎发育至2_3天，挑选若干枚正常发育的胚胎，抽提基因组DNA，并对cebpa基因进行PCR扩增，PCR扩增产物通过限制性内切酶的方法鉴定TALEN是否有效的步骤。4.根据权利要求3所述的Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，对cebpa基因进行PCR扩增采用的引物序列如SEQIDN0•3、SEQIDN0.4所示。5.根据权利要求1所述的Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤S6中还包括克隆斑马鱼cebpa突变基因至pCS2+表达载体中，通过荧光素酶报告实验检测该突变Cebpa是否还具有转录活性功能的步骤。6.根据权利要求1所述的Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤S6中还包括将F2代cebpa突变体自交产生的胚胎养至4_6天，利用苏丹黑染色的方法检测cebpa基因敲除胚胎的粒细胞发育情况的步骤。7.—种根据权利要求1所述的Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备方法建立的cebpa基因缺失斑马鱼模型在作为针对治疗白血病，肝脏发育不良以及粒细胞缺失疾病的药物筛选模型中的用途。

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