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申请/专利权人：云南大学

摘要：本发明公开了一种通过微生物固体发酵产生抗生素TMC‑154的方法。即：微生物Clonostachys rogersoniana 828H2CGMCC No.12073在合适的培养条件下固体发酵，经过合适的溶剂超声提取，过滤，浓缩后，经硅胶和凝胶柱层析分离得到抗生素TMC‑154。结合TLC薄层层析法以及高效液相色谱法，可检测到大量的TMC‑154的产生。TMC‑154对人体白血病早幼粒细胞株HL‑60，人体肝癌细胞株SMMC‑7721，人体非小细胞肺癌细胞株A‑549，人体乳腺癌细胞株MCF‑7及人体结肠癌细胞株SW‑480都表现出明显的抑制活性，其半数抑制率IC50值分别为2.13μM，15.38μM，17.49μM，15.80μM和14.54μM，具有开发为抗癌药物的潜质。该方法提供了抗生素TMC‑154的一个新的生产方法。

主权项：一种通过微生物Clonostachys rogersoniana发酵产生抗生素TMC‑154的方法，其特征在于按如下步骤进行固体发酵：1将拟用微生物Clonostachys rogersoniana 828H2首先进行活化，即将C.rogersoniana 828H2接种到经过120℃高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养3‑7d后，置于4℃冰箱中备用；2将活化的菌种接到PDB种子培养基中，于恒温摇床中培养3‑7d；3取洗净的土豆切成丁后，取适量置于组织培养瓶中，加入阿拉伯糖以质量百分比计所述发酵培养基成分：25g马铃薯，0.5g阿拉伯糖；将装有培养基的组织培养瓶加盖包装后置于120℃高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将组织培养瓶冷却；4将步骤2的种子培养基在无菌环境下接种到经过步骤3前处理的培养基上，加盖后置于培养箱中28℃下培养30d后取出；5经微生物C.rogersoniana 828H2发酵后的培养基经过甲醇超声提取、过滤和浓缩得到粗提物；分离粗提物得到的TMC‑154的结构式如下：6经TLC薄层层析法检测，然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇10:1—3:1，然后经分离得到的化合物上凝胶柱甲醇纯化，通过1D2D NMR以及HR‑ESIMS鉴定得到TMC‑154结构。7采用HPLC测定TMC‑154的产量为3.78gkg。

全文数据：_种通过固体发酵微生物GIonostachysrogersoniana产生抗生素TMC-154的方法技术领域[0001]本发明涉及微生物代谢产物分离分析领域，具体来说建立了一种通过固态发酵微生物01〇11〇8丨&〇]15^1'〇〖618〇11丨&11&产生抗生素1]\10154的方法。[0002]本发明使用的微生物Clonostachysrogersoniana:[Clonostachyssp828H2保藏号:CGMCCNo.12073]保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;保藏时间：2016年1月15日。背景技术[0003]近年来，因微生物具有代谢周期短、转化反应条件温和、副产物少、立体选择性强等特点，通过微生物真菌、细菌以及藻类发酵来制备特定化合物的方法越来越受到人们的重视。在实际生产中，已经有大量的应用实例通过微生物发酵来生产一些新颖的、活性较高的以及对人体健康有益的药物。[0004]TMC-154是聚酮苷类化合物，其结构特征在于具有一个独特的高度甲基化的erythromycins类型聚酮母核、一个阿拉伯醇侧链和一个甲基甘露糖取代。文献报道该类化合物对多种肿瘤细胞具有生长抑制活性，且对二酰甘油乙酰转移酶DGAT具有抑制活性。在体外细胞毒活性筛选实验中，TMC-154对人体白血病早幼粒细胞株HL-60，人体肝癌细胞株SMMC-7721，人体非小细胞肺癌细胞株A-549,人体乳腺癌细胞株MCF-7及人体结肠癌细胞株SW-480均表现出明显的抑制活性，其半数抑制率IC5q值分别为2.13μΜ，15.38μΜ，17.49μΜ，15.80μΜ和14.54μΜ。而阳性对照顺铂对五株人类肿瘤细胞HL-60，Α-549，SMMC-7721，MCF-7和SW-480的IC5Q值依次为I·72μΜ，6·82μΜ，12·19μΜ，17·40μΜ和16·35y]\LTMC-154对人体乳腺癌细胞株MCF-7和人体结肠癌细胞株SW-480的生长抑制活性强于阳性对照顺铂。因此，TMC-154具有作为先导化合物开发抗肿瘤药物的研究价值。而基于微生物发酵的大量而简单的产生抗生素TMC-154的方法，不仅可以现代环境保护和低碳经济的需求，而且为后期工业化量产的进一步研究和开发打下了坚实的基础，具有显著的应用价值。发明内容[0005]本发明旨在通过Clonostachysrogersoniana固体发酵生产抗生素TMC-154。本发明提供了一种转化率高，设备要求低，简便易操作，绿色无污染，适合产业化生产TMC-154的方法。[0006]本发明的目的是通过以下具体技术方案实现的：[0007]1将拟用微生物C.rogersoniana828H2菌种保藏号CGMCCNo.12073首先进行活化，即将C.rogersoniana828H2接种到经过120°C高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养3-7d后，置于4°C冰箱中备用；[0008]⑵将活化的菌种接到I3DB种子培养基中，于恒温摇床中培养3-7d;[0009]3取洗净的土豆切成丁后，取适量置于组织培养瓶中，加入阿拉伯糖（以质量百分比计所述发酵培养基成分:25g马铃薯，0.5g阿拉伯糖）；将装有培养基的组织培养瓶加盖包装后置于120°C高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将组织培养瓶冷却；[0010]4将步骤（2的种子培养基在无菌环境下接种到经过步骤（3前处理的培养基上，加盖后置于培养箱中28°C下培养30d后取出；[0011]5经微生物C.rogersoniana828H2发酵后的培养基经过甲醇超声提取、过滤和浓缩得到粗提物;分离粗提物得到的TMC-154的结构式如下：[0013]6经TLC薄层层析法检测，然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇（10:1-3:1，然后经分离得到的化合物上凝胶柱（甲醇纯化，通过1D2DNMR以及HR-ES頂S鉴定得到TMC-154结构；[0014]⑵采用如下HPLC色谱条件测定TMC-154的产量。[0015]①色谱柱：ZORBAXSB-Cl84.6X250mm，5μπι;[0016]②梯度洗脱程序：0-1011^11，20-40%乙腈；10-201^11，40-60%乙腈；20-451^11，60%乙腈；[0017]③检测波长：235nm;[0018]④流速：I.OmLmin;[0019]⑤柱温：20°C。附图说明[0020]图1为本发明中目标化合物的1H-NMR;[0021]图2为本发明中目标化合物的13C-NMR;[0022]图3为本发明中目标化合物的HSQC;[0023]图4为本发明中目标化合物的HMBC;[0024]图5为本发明中目标化合物的HR-ESI-MS。具体实施方式[0025]下面结合实施例进一步阐述本发明，但本发明不局限于该具体实施例，本领域技术人员应该认识到，本发明涵盖了权利要求范围内的所有可能的备选方案、改进方案和等效方案。[0026]实施例1[0027]1将拟用微生物Clonostachysrogersoniana828H2首先进行活化，即将C.rogersoniana接种到经过120°C高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养3-7d后，置于4°C冰箱中备用；[0028]2将活化的菌种接到I3DB种子培养基中，于恒温摇床中培养3-7d;[0029]3取洗净的土豆切成丁后，取适量置于组织培养瓶中，加入阿拉伯糖（以质量百分比计所述发酵培养基成分:25g马铃薯，0.5g阿拉伯糖）；将装有培养基的组织培养瓶加盖包装后置于120°C高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将组织培养瓶冷却；[0030]4将步骤（2的种子培养基在无菌环境下接种到经过步骤（3前处理的培养基上，加盖后置于培养箱中28°C下培养30d后取出；[0031]5经微生物C.rogersoniana828H2发酵后的培养基经过甲醇超声提取、过滤和浓缩得到粗提物;分离粗提物得到的TMC-154的结构式如下：[0033]6经TLC薄层层析法检测，然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇（10:1-3:1，然后经分离得到的化合物上凝胶柱（甲醇纯化，通过1D2DNMR以及HR-ES頂S鉴定得到TMC-154结构；[0034]⑵采用如下HPLC色谱条件测定TMC-154的产量为3.78gKg。[0035]①色谱柱：ZORBAXSB-Cl84·6X250mm，5μπι;[0036]②梯度洗脱程序：0-IOmin，20-40%乙腈；10-20min，40-60%乙腈；20-45min，60%乙腈；[0037]③检测波长：235nm;[0038]④流速：I·OmLmin;[0039]⑤柱温：20°C。[0040]该方法是一种高效的，具有创新性的，反应条件温和的，绿色无污染的，易扩大化生产的，操作设备简单的大量产生抗生素TMC-154的方法，不仅满足了现代环境保护和低碳经济的需求，而且为后期工业化量产的进一步研究和开发打下了坚实的基础。[0041]实施例2[0042]操作同实施例1，把发酵时间改为35d后，了1«：-154的产量为3.7681^。[0043]实施例3[0044]操作同实施例1，把发酵时间改为401后，了1：-154的产量为3.6981^。

权利要求：1.一种通过微生物Clonostachysrogersoniana发酵产生抗生素TMC-154的方法，其特征在于按如下步骤进行固体发酵：⑴将拟用微生物Clonostachysrogersoniana828H2首先进行活化，即将C.rogersoniana828H2接种到经过120°C高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养3_7d后，置于4C冰箱中备用；⑵将活化的菌种接到I3DB种子培养基中，于恒温摇床中培养3-7d;3取洗净的土豆切成丁后，取适量置于组织培养瓶中，加入阿拉伯糖（以质量百分比计所述发酵培养基成分:25g马铃薯，0.5g阿拉伯糖）；将装有培养基的组织培养瓶加盖包装后置于120°C高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将组织培养瓶冷却；4将步骤2的种子培养基在无菌环境下接种到经过步骤3前处理的培养基上，加盖后置于培养箱中28°C下培养30d后取出；5经微生物C.rogersoniana828H2发酵后的培养基经过甲醇超声提取、过滤和浓缩得到粗提物;分离粗提物得到的TMC-154的结构式如下：6经TLC薄层层析法检测，然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇（10:1-3:1，然后经分离得到的化合物上凝胶柱（甲醇纯化，通过1D2DNMR以及HR-ES頂S鉴定得到TMC-154结构。⑵采用HPLC测定TMC-154的产量为3.78gkg。2.根据权利要求1所述通过C.rogersoniana828H2发酵产生抗生素TMC-154的方法，其特征在于保藏编号为CGMCCNo.12073。3.根据权利要求1所述通过C.rogersoniana828H2发酵产生抗生素TMC-154的方法，其特征在于产生了抗生素TMC-154,化学结构为：4.根据权利要求1所述通过C.rogersoniana828H2发酵产生抗生素TMC-154的方法，其特征在于所述发酵方法为固态发酵。5.根据权利要求1所述通过C.rogersoniana828H2发酵产生抗生素TMC-154的方法，其特征在于以质量百分比计所述发酵培养基成分:25g马铃薯，0.5g阿拉伯糖。6.根据权利要求1所述通过C.rogersoniana828H2发酵产生抗生素TMC-154的方法，其特征在于所述发酵时间为30d。7.根据权利要求1所述通过C.rogersoniana828H2发酵产生抗生素TMC-154的方法，其特征在于所述发酵温度为28°C。8.根据权利要求1所述通过^.1'〇^6『8〇111&11&828!12发酵产生抗生素110154的方法，其特征在于按如下HPLC条件进行含量测定，产量为3.78gkg。1色谱柱：ZORBAXSB-C184.6X250mm，5um;2梯度洗脱程序：0-10111；!_11，20-40%乙腈；10-20111；!_11，40-60%乙腈；20-45111；!_11，60%乙臆；⑶检测波长：235nm;⑷流速：1·OmLmin;⑶柱温:20°C。

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