买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

摘要：本发明提供了一株脱氯艾德昂菌及其应用，所述的菌为艾德昂菌Ideonella sp.FZJG233，该菌株已于2016年1月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.12059。通过菌株将空气中游离的氮转为氨，供作物吸收利用，从而能够显著促进大麦等作物生长的菌株及对水稻稻瘟病菌具有拮抗作用，可以抑制水稻稻瘟病菌的发生。

主权项：一种脱氯艾德昂菌，其特征在于：所述菌为艾德昂菌Ideonella sp. FZJG233，该菌株已于2016年1月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.12059。

全文数据：一株脱氯艾德昂菌及其应用技术领域本发明属于微生物领域，涉及一株脱氯艾德昂菌及其应用，该脱氯艾德昂菌IdeonelladechloratansFZJG233能将空气中游离的氮转为氨对大麦有着明显的促生作用及对水稻稻瘟病菌具有拮抗作用，可以抑制水稻稻瘟病菌的发生。背景技术内生固氮菌是一类具有固氮能力的微生物，它的主要宿主是非豆科作物。人们在研究内生固氮菌时发现某些菌类能提供植物高达70%的氮量。发掘内生固氮菌的资源已成为非豆科作物高效利用生物固氮战略的主攻方向之一。长期以来，为了确保农产品获得高产，人们大量使用化学肥料和农药，这样既造成了土壤结构的破坏及环境的污染，又不利于农业的可持续发展。通过微生物的作用将空气中游离的氮转为氨，供植物吸收利用，从而促进作物的生长。从福建农林大学菌草所基地巨菌草根中筛选到具有高固氮酶活性的脱氯艾德昂菌菌株，通过将空气中游离的氮转为氨，供植物吸收利用，从而促进作物生长具有重要的意义。水稻稻瘟病是危害水稻最为严重的三大病害之一，可引起大幅度减产，严重时减产40%~50%，甚至颗粒无收。该菌株具有拮抗稻瘟病病菌，从而抑制水稻稻瘟病的作用。发明内容本发明的目的在于提供一株脱氯艾德昂菌及其应用，提供具有高效固氮酶活性、生长速度快、对环境适应性强的内生固氮菌株。通过菌株将空气中游离的氮转为氨，供作物吸收利用，从而能够显著促进大麦等作物生长的菌株。该菌株还具有抑制水稻稻瘟病病菌的作用。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明通过采用选择性培养基在厌氧和好氧培养条件下，利用CCM与NFB两种选择性无氮培养基从福建农林大学菌草所基地巨菌草根中进行内生固氮菌的分离纯化。将分离纯化到的内生固氮菌株进行活化后，用乙炔还原法和15N2同位素标记，固氮酶活性为351.21nmol.mL-1h-1，15N测定丰度为26.55%，发现该菌株能够将空气中游离的氮转为氨，可作为促生剂对大麦具有明显的促生长用。该菌株还具有抑制水稻稻瘟病病菌的作用。本发明所述的巨菌草固氮菌为艾德昂菌Ideonellasp.FZJG233，已于2016年01月21日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCCNo.12059。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明脱氯艾德昂菌具有如下形态和生理、生化特性：a、菌体形态特性该脱氯艾德昂菌为革兰氏阳性菌，细胞呈杆状，大小为0.6-0.8×1.1-1.6∽μm。b、菌落形态特性LB琼脂平板上生长速度较快，菌落圆形（28.5℃，生长48小时），表面光滑呈粘液状，边缘整齐，乳白色，菌落直径4-9毫米。最适生长温度是25-37℃及最佳生长pH值7.0。c、生理生化特性以糊精、D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、水苏糖、棉籽糖、蜜二糖、β-甲酰-D-葡糖苷、D-水杨苷、N-乙酰-D-葡糖胺、α-D-葡糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿拉伯醇D-葡糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、D-丝氨酸、醋竹桃霉素、利福霉SV、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-组胺、林肯霉素、硫酸四癸钠、D-半乳糖醛酸、L-半乳糖醛酸内酯、D-葡糖酸、D-葡糖醛酸、葡糖醛酰胺、粘液酸、奎宁酸、糖质酸、万古霉素、四唑紫、四唑蓝、L-乳酸、柠檬酸、L-苹果酸为碳源的代谢为阳性；以D-丝氨酸、α-酮-戊二酸、亚碲酸钾、α-羟基-丁酸、α-酮-丁酸、丙酸、甲酸、溴酸钠为的碳源的代谢为阴性；pH生长可耐pH5-pH6；耐NaCl的浓度可达8%；明胶液化为阳性；触酶反应为阳性；水解淀粉为阳性；革兰氏染色为阳性；溶解无机磷的能力为阳性；对稻瘟病菌具有一定的拮抗力。该菌株的16SrRNA基因序列如SEQIDNO.1所示。本发明具有高效固氮酶活性菌株FZJG233的分子分类地位的确定：采用细菌16SrRNA基因通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）进行扩增，将PCR产物直接进行序列测定，将获得的16SrDNA序列输入GenBank进行比对，初步确定本发明的菌株FZJG233在分类学中的种、属的位置。结果发现本发明的菌株FZJG233，与脱氯艾德昂菌Ideonelladechloratans模式菌株NR0261081相似性为99%。16SrRNA基因序列分析，本发明的脱氯艾德昂菌Ideonelladechloratans.应归属于脱氯艾德昂菌Ideonelladechloratans。本发明菌种的分离纯化方法如下：将生长于福建农林大学菌草所基地巨菌草的根用蒸馏水洗净，剪下长度3-5cm根置于灭菌的培养皿中，用3%的双氧水H2O2浸泡4min（以除去根、茎、叶表面的腐烂物质），无菌水洗涤一次，再用70%乙醇浸泡5min，再用0.1%的HgCl2浸泡3min，无菌水洗涤7次，每次5-10min，并将最后一次洗涤液涂布于固体培养基，以检测消毒是否彻底。将表面消毒完全的根用灭菌剪刀剪碎，分别用灭菌镊子夹入到3支装有NFB半固体培养基的试管中，胶塞密封后，至于28℃的细菌培养箱内进行培养。待试管中长出菌体后，向管内注入110体积10%乙炔气体（终浓度为1%），24h后，测定固氮酶活性（乙炔还原法）。将具有固氮酶活性的菌株从半固体管中接至相应的固体培养基上，平板划线分离，28℃，湿度为85％条件下，进行厌氧及好氧培养。再挑取单菌落分别接种至半固体培养基试管中，以检测固氮酶活性，再涂平板直到获得纯的菌株，最后通过镜检，进一步观察其形态及确定纯化与否。纯化后的菌株于15%的甘油中-20℃保存。NFB培养基构成:malicacid苹果酸5.0gL，K2HPO40.5gL，MgSO4·7H2O0.2gL，NaCl0.1gL，CaCl20.02gL，0.5%bromthymolblue2.0mLL先溶解在0.2NKOH溶液中，vitaminsolution维生素液1.0mLL，micronutrientsolution微量元素液2.0mLL，1.64%Fe-EDTAsolution4.0mLL，KOH4.5gL，pH=6.8。其中vitaminsolution维生素液组成为：biotin生物素100.0mgL，pyridoxol-HCl盐酸吡哆醇，维生素B6200.0mgL;micronutrientsolution微量元素液组成为：CuSO40.4gL，ZnSO4·7H2O0.12gL，H2BO31.4gL,Na2MoO4·2H2O1.0gL，MnSO41.5gL固体培养基中加入1.7wt.%的琼脂，半固体培养基中加入0.15-0.25wt.%的琼脂。本发明的菌种可作为促生剂以促进大麦及禾本科作物生长。如可将分离纯化得到的单菌落采用LB液体培养基于28℃培养48小时，菌液OD600值达0.6时浓度为6×108cfumL的菌液,以接种同样体积的清水的为对照，每盆大麦浇灌菌液15ml，隔1d后菌液再灌根一次，15天后与未接种的对照相比，大麦的叶长、根长、鲜重、根重都达到了明显差异，对大麦有明显的促生作用。制备浓度为6×108cfumL的菌液的制备过程为：取5mL培养24h后的内生菌菌液在12000rmin，10min的条件下离心，用去离子水清洗后再离心，然后将收集的菌体悬浮于0.03MMgSO4溶液中，并稀释至所测OD600为0.6，即得对应浓度为6×108cfumL的菌液。本发明的菌种可作为抑菌剂抑制水稻稻瘟病菌的发生。取10μl过夜培养的内生菌菌液滴于PDA培养基的中部，切取0.3cm×0.3cm大小培养3-5d的稻瘟病原菌菌块于PDA培养基边缘一侧，28℃培养1-2d后，每个培养皿3种稻瘟病菌，进行对峙培养，每个重复3次。培养3-5d后进行结果观察，内生菌FZJG233对水稻稻瘟病病原菌具有强拮抗作用。（三）接种及抑菌效果本发明为一株具有高效固氮酶活性的脱氯艾德昂菌。它来源于福建农林大学菌草所基地巨菌草根部，能够固定空气中的氮气，对大麦具有明显的促生长作用。本发明的菌种可作为抑菌剂抑制水稻稻瘟病菌的发生。本发明的优点在于：本发明提供具有高效固氮酶活性、生长速度快、对环境适应性强的内生固氮菌株。通过菌株将空气中游离的氮转为氨，供作物吸收利用，从而能够显著促进大麦等作物生长的菌株。该菌株还具有抑制水稻稻瘟病病菌的作用。附图说明图1接种脱氯艾德昂菌Ideonellasp.FZJG233促进大麦生长，CK为未接种脱氯艾德昂菌菌株大麦苗，FZJG415为接种脱氯艾德昂菌菌株FZJG233。图2脱氯艾德昂菌Ideonellasp.FZJG233抑菌的产生。具体实施方式通过下面给出的本发明的具体接种例可以进一步清楚地理解本发明。应理解此接种例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1菌株的分离鉴定的过程如下：将采集的生长于福建农林大学菌草所基地巨菌草的新鲜根样本用蒸馏水洗净，然后剪下根、茎、叶并分别置于已灭菌的三个培养皿中，用3%的双氧水H2O2浸泡4min以除去根、茎、叶表面的腐烂物质，无菌水洗涤一次，再用0.1%的升汞HgCl2浸泡5min，无菌水中振动洗涤5次，每次5-8min。将表面消毒完全的根、茎、叶用已灭菌手术刀切碎，分别接种到三支装有5mlNFB半固体培养基的试管中，胶塞密封后，置于28℃的人工培养箱内进行培养。整个操作均在无菌条件下完成。待长出菌体后，向管内注入110体积10%乙炔气体（终浓度为1％），在相同条件下再培养24h，用乙炔还原法测定其固氮酶活性。将具有高固氮酶活性的菌株从半固体管中接至相应的固体培养基上，平板划线分离，28℃，湿度为85％条件下，进行厌氧及好氧培养。再挑取单菌落分别接种至半固体培养基试管中，检测固氮酶活性，再涂平板直到获得纯的菌株，最后通过镜检，进一步观察其形态，并确定已纯化。采用细菌16SrRNA基因通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）进行扩增，将PCR产物直接进行序列测定，将获得的16SrDNA序列输入GenBank进行比对，初步确定本发明的菌株FZJG233在分类学中的种、属的位置。结果发现本发明的菌株FZJG233，与脱氯艾德昂菌Ideonelladechloratans模式菌株NR0261081相似性为99%。16SrRNA基因序列分析，本发明的脱氯艾德昂菌Ideonelladechloratans.应归属于脱氯艾德昂菌Ideonelladechloratans。实施例2将活化得到的单菌落采用LB液体培养基于28℃培养48小时，培养得到的培养液OD600值为0.6时，制备浓度为6×108cfumL的菌液，以接种同样体积的清水的为对照，每盆大麦浇灌菌液15ml，隔1d后菌液再灌根一次，15天后与未接种的对照相比，大麦的叶长、根长、鲜重、根重都达到了显著差异，对大麦有明显的促生作用。其中叶长增加了26.1%，根增长了21.2%，根重增加了48.2.2%，鲜重增加了100.2.%，干重增加了63.6.%（表1），促大麦生长效果见图1。表1菌株FZJG233接种水稻后的促生效果实施例3本发明的菌种可作为抑菌剂抑制水稻稻瘟病菌的发生。取10μl过夜培养的内生菌菌液滴于PDA培养基的中部，切取0.3cm×0.3cm大小培养3-5d的稻瘟病原菌菌块于PDA培养基边缘一侧，28℃培养1-2d后，每个培养皿3种稻瘟病菌，进行对峙培养，每个重复3次。培养3-5d后进行结果观察，内生菌FZJG233对水稻稻瘟病病原菌具有拮抗作用（图2）。SEQUENCELISTING福建农林大学一株脱氯艾德昂菌及其应用33PatentInversion3.311440DNA人工序列1cgctggcggcatgccttacacatgcaagtcgaacggtaacgcggggcaacctggcgacga60gtggcgaacgggtgagtaatgcatcggaacgtgcccagtagtgggggatagcccggcgaa120agccggattaataccgcatacgacctgagggtgaaagggggggatcgcaagacctctcgc180tattggagcggccgatgtcagattaggtagttggtggggtaaaggcctaccaagccgacg240atctgtagctggtctgagaggacgaccagccacactgggactgagacacggcccagactc300ctacgggaggcagcagtggggaattttggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgcc360gcgtgcgggaagaaggccttcgggttgtaaaccgcttttgtcagggaagaaatcttctgg420gttaatacctcgggaggatgacggtacctgaagaataagcaccggctaactacgtgccag480cagccgcggtaatacgtagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgtgcg540caggcggttttgtaagacagaggtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcctttgtg600actgcaaggcttgagtgcggcagagggggatggaattccgcgtgtagcagtgaaatgcgt660agatatgcggaggaacaccgatggcgaaggcaatcccctgggcctgcactgacgctcatg720cacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatg780tcaactggttgttgggaaggttccttctcagtaacgtagctaacgcgtgaagttgaccgc840ctggggagtacggccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcgg900tggatgatgtggtttaattcgatgcaacgcgaaaaaccttacctacccttgacatggcag960gaatcctgaagagatttgggagtgctcgaaagagaacctgcacacaggtgctgcatggcc1020gtcgtcagctcgtgtcgtgagatgtgggtaagtcccgcacgagcgcaacccttgtcatta1080gttgctacgaaagggcactctaatgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggat1140gacgtcaggtcctcatggcccttatgggtagggctacacacgtcatacaatggccggtac1200agagggctgccaacccgcgagggggagccaatcccagaaaaccggtcgtagtccggatcg1260cagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcttgccgc1320ggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagcgggttctgc1380cagaagtagttagcctaaccgcaaggagggcgattaccacggcagggttcgtgactgggg1440219DNA人工序列2agagtttgatcctggctca19319DNA人工序列3ggttaccttgttacgactt19

权利要求：1.一种脱氯艾德昂菌，其特征在于：所述脱氯艾德昂菌为艾德昂菌Ideonellasp.FZJG233，该菌株已于2016年1月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.12059。2.一种如权利要求1所述的脱氯艾德昂菌在促进大麦生长上的应用。3.一种如权利要求1所述的脱氯艾德昂菌在制备大麦促进生长剂上的应用。4.一种如权利要求1所述的脱氯艾德昂菌在抑制水稻稻瘟病菌上的应用。

百度查询： 福建农林大学 一株脱氯艾德昂菌及其应用