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申请/专利权人：农业部沼气科学研究所

摘要：本发明公开了一株暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensisBERC‑11及其应用，保藏于广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号：GDMCC No.60223。本发明筛选的菌株BERC‑11可以耐受3.5g L‑1呋喃甲醛，在3.5g L‑1呋喃甲醛浓度下，滤纸酶活达到0.1Uml，CMC酶活达到0.21Uml,纤维二糖酶活达到0.07Uml，可以在木质纤维素预处理过程中发挥作用。

主权项：一株暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensisBERC‑11，保藏于广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号：GDMCC No.60223。

全文数据：一株暹罗芽孢杆菌BERG-11及其应用技术领域[0001]本发明属于微生物领域，具体涉及一株耐呋喃甲醛的纤维素降解菌及其应用。背景技术[0002]木质纤维素的生物质转化是解决环境污染、能源危机的重要手段之一，近三十年，研究者聚焦于木质纤维素转化为燃料、能源及高附加值的化学产品。但木质纤维素转化过程中产生大量的中间有毒的代谢抑制物。呋喃甲醛是木质纤维素转化过程中产生的代谢物，它能损坏细胞膜和细胞壁，降解DNA，阻碍蛋白质及RNA的合成，抑制生物活性，灭杀细胞。克服这些来自于木质纤维素的有毒化合物是发展低成本、可持续的生物质燃料的重要挑战。[0003]微生物资源是工业发酵的基础，许多研究者已经将耐受呋喃甲醛的发酵菌株应用在生物质燃料的工业发酵中及通过筛选耐受微生物，发掘一些耐受基因整合到发酵菌株，Sarahjfield等在研究乙醇发酵体系时筛选到了可以在3gL的呋喃甲醛生长的Saccharomycescerevisiae及Saccharomycesparadoxus，但高浓度的咲喃甲酸影响了乙醇的生产。刘等筛选出耐受咲喃甲醛的乳酸发酵菌株bacilluslauguigueB38。一些与耐受咲喃甲醛相关的基因，被整合到ZymomonasmobiIis,Escherichiacoli中，提高了乙醇的产量及对呋喃甲醛的耐受浓度。尽管如此，研究者都聚焦于发酵菌株，而耐受呋喃甲醛的纤维素降解菌鲜有报道。发明内容[0004]本发明所要解决的技术问题为:如何提供一种高呋喃甲醛耐受性的纤维素降解菌株。[0005]本发明的技术方案为:一株暹罗芽孢杆菌BacillussiamensisBERC-Il，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期2017年8月17日，保藏地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号:GDMCCNo.60223。以下均简称为菌株BREC-11〇[0006]含有菌株BERC-11的发酵液或培养液。[0007]菌株BERC-Il或其发酵液或培养液在木质纤维素物质的预处理上的应用。[0008]菌株BERC-Il或其发酵液或培养液在微生物肥料制备中的应用。[0009]本发明的菌株BREC-Il能耐受高浓度呋喃甲醛，且保持很高的纤维素酶活性，可降解木质纤维素，因此可以广泛用于含木质纤维素物质的预处理，为木质纤维素物质的产业化提供帮助。也可以用于微生物肥料的制备中，加速有机质的木质纤维素的降解。[0010]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：[0011]本发明以呋喃甲醛为抑制物，通过纤维素降解培养基连续富集培养，分离到一株高耐受性的纤维素降解菌，经过多相分类学的初步鉴定菌株是芽孢杆菌属的一个种。命名为暹罗芽孢杆菌BacillussiamensisBERC-Il。本发明筛选的菌株BERC-Il可以耐受3.5gI1呋喃甲醛，在3.5gI1呋喃甲醛浓度下，滤纸酶活达到O.lUml，CMC酶活达到0.21Uml，纤维二糖酶活达到0.07Uml，可以在木质纤维素预处理过程中发挥作用。附图说明[0012]图1为刚果红染色图；[0013]图2为菌株BREC-Il的光学显微镜观察；[0014]图3为利用NJ法构建的基于16SrDNA的菌株系统发育树；[0015]图4为菌株BREC-Il的总酯成分；[0016]图5为菌株BREC-Il在不同浓度呋喃甲醛下的生长情况；[0017]图6为菌株BREC-Il在3.5gL呋喃甲醛条件下的纤维素酶活。具体实施方式[0018]实施例1[0019]1.材料与方法[0020]1.1虫体来源[0021]竹虫OmphisafuscidentalisHampson幼虫采于云南省西双版纳傣族自治州。[0022]1.2试剂与培养基[0023]羧甲基纤维素CMC和水杨素Salicin均由Sigma公司生产，微晶纤维素MCC由Fluka公司生产，呋喃甲醛由天津市博迪化工有限公司生产，其他试剂未有特别说明均为国产分析纯。[0024]改良赫奇逊无机盐培养基（KH2P〇41.0g，NaCl0.1g，MgS〇47H200.3g，NaN032.5gFeCl30.01g，CaCl20.1g，CMC-Na5g，H201L添加不同浓度的呋喃甲醛，CMC发酵产酶培养基CMCNa10g，蛋白胨5g，酵母粉I.Og添加琼脂18g制成固体培养基。脂肪酸分析培养基为TSA培养基BDDifco236950,美国）。[0025]1.3耐受呋喃甲醛的纤维素降解菌的分离[0026]选取10只虫体，表皮消毒，在无菌操作台中抽取肠道，放入无菌水中充分匀浆，吸取匀浆液5ml放入IOOml添加0.5gL呋喃甲醛的改良的赫奇逊无机盐培养基中30°C，150rmpmin.培养36h后，吸取5ml转移到添加lgL的呋喃甲醛的培养基中，震荡培养，连续富集直至培养基中呋喃甲醛的浓度达到5gL，采用平板稀释涂布的方法分离菌株，将IOOul稀释液均匀涂布于CMC发酵培养基的平板上，30°C恒温倒置培养36h，挑取单菌落划线培养，直至纯化至单一菌株，将挑取的单一菌株点接到CMC发酵固体平板，30°C培养3d后，刚果红染色初筛纤维素降解菌。[0027]1.4菌株鉴定[0028]对分离到的菌株进行形态学观察、生理生化试验、16SrRNA基因序列分析以及细胞化学组分分析。[0029]菌株的形态及生理生化特性参考文献（Ruan，Z.，Wang，Y.，Song，J.，Jiang，S.，WangjH.,LijY-,Zhao,B.Kurthiahuakuiisp.nov.,isolatedfrombiogasslurry,andemendeddescriptionofthegenusKurthia.Internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology，2014,642,518-521的方法进行D16SrRNA基因序列分析以及细胞化学组分分析参考（Xu，X.W.，Huo，Y.Y.，Wang，C.S.，Oren，A.，Cui，H.L.，Vedler,E.,ffu,M.Pelagibacteriumhalotoleransgen.ηov.,sp.nov.andPelagibacteriumluteolumsp.nov.,novelmembersofthefamilyHyphomicrobiaceae.Internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology,2011,61⑶，1817-1822.的方法进行。[0030]1.5菌株呋喃甲醛耐受浓度测定[0031]筛选到的菌株分别接种到含有0，0·5，1，1·5,2·0,2·5,3·0,3·5,4·0,4·5,5·0，5.5,6.^凡呋喃甲醛的培养基中，每组三个重复，一个不接种菌种的作为空白对照，301€150rmpmin震荡培养3d，吸光值OD6qq测定菌体生长情况。[0032]1.6菌株纤维素酶的测定。[0033]菌株分别在添加3.5gL的改良的赫奇逊培养基（KH2P041.0g，NaClO.lg，MgS047H200.3g，NaN032.5gFeC130.01g，CaC12O.lg,CMC-Na5g，H201L及未添加呋喃甲醛的培养基培养30°C，培养3d后，4°C，SOOOrpm离心IOmin，上清液作为粗酶液，纤维素酶活性的测定采用DNS法Oppertetal.，2010;Shietal.，2011。本研究分别对滤纸酶活力FPA、内切β-l，4-葡聚糖酶CMC和β-葡萄糖苷酶β-G的活性进行比较测定。滤纸酶活力的测定用Whatmanl号滤纸（lcmX6cm—条为底物，CMC酶的测定用1%羧甲基纤维素钠为底物，葡萄糖苷酶的测定用2%水杨素为底物。各底物分别用pH值为3，4，5，6，7，8的磷酸二氢钠一柠檬酸缓冲液〇.2mol·I1和pH为9的甘氨酸一氢氧化钠缓冲液0.2mol·L一3配制。取稀释酶液0.ImL与0.5mL上述底物充分混匀，在50°C水浴中温浴30min，40min，60min后，加入DNS显色剂2mL，沸水浴显色IOmin，流水冷却，在540nm下测定OD值，每测定重复3次，取平均值，同时设空白对照。以试验条件下酶液蛋白含量mg在单位时间min内酶促反应产生的还原糖（葡萄糖）量ymol计算酶活性，S卩μπιοίlirTVg^Shietal.，2011〇[0034]2.结果与分析[0035]2.1耐受呋喃甲醛的纤维素降解菌的分离[0036]经过刚果红染色初筛，筛选到三株降解菌株，如图1所示。其中编号0-2的菌株的透明圈菌落直径最大，菌落直径为2.2，将其命名为菌株BREC-11。[0037]2.2菌株BREC-Il鉴定[0038]菌株BREC-11是革兰氏阳性细菌，兼性厌氧，可移动。在TSA平板上菌落呈灰白色、不透明、边缘光滑、表面微粗糙。菌体形态如图2所示，杆状，大小为0.3-0.6X1.5-3.5μπι。生长温度为10〜50°C，pH范围：5〜9,耐受NaCl浓度为8%WV。可利用葡萄糖，蔗糖，木糖，果糖，乳糖，糖原，甘油，核糖，肌醇，甘露醇，棉子糖，麦芽糖作为碳源。菌株BREC-11的部分生理生化实验结果如表1所示。[0039]表1:菌株BERC-Il部分生理生化结果[0040][0041]获得1430bp的基因组序列，菌株BERC-ll的16SrDNA在Eztaxte网站比对分析，结果显示菌株BREC-Il与BacillussiamensisKCTC13613T的相似度达到99.93%，构建系统发育树，如图3表明，菌株BERC-11与BaciIlussiamensisKCTC13613T在同一亚枝，稳定性较高，进化关系相近。系统发育树及序列分析结果表明，菌株BERC-11归为芽孢杆菌属Bacillus〇[0042]菌株BREC-Il的脂肪酸类型主要包含，1^6丨8〇-：15:41.36%和31^6丨8〇-：17:〇23.31%，在同iso_Ci5:o10·3%的含量上与PunnaneeSumpavapol测定的BaciIIussiamensisKCTC13613T的主要脂肪酸类型存在有差异，BacillussiamensisKCTC13613%9脂肪酸中iS0-C15:ο的含量是9.8%低于菌株BERC-11的脂肪酸中的iS0-C15:ο。菌株BERC-11的极性月旨类型包括diphosphatidylglycerol,phosphatidylglycerol，phosphatidylethanoIamine，Iysylphosphatidylglycerol，glycolipid，l种未知的!11；[11^1108。11011。11，4种未知111；[11011。118和2种未知的11。118如图4。[0043]经过形态学，生理生化试验，细胞化学分析，16rRNA序列分析，菌株BERC-Il是芽抱杆菌属Bacillus的一个种，命名为逼罗芽抱杆菌BacillussiamensisBERC-11。[0044]2.3菌株BERC-11的呋喃甲醛耐受浓度测定[0045]菌株BERC-Il耐受呋喃甲醛结果分析如图5所示，当培养基中呋喃甲醛的浓度达到1.5gL时，生长受到影响，但是还可以正常生长，直到呋喃甲醛的浓度达到4.OgL时，吸光值下降，呋喃甲醛抑制了菌株BREC-Il的生长。呋喃甲醛可以破坏细胞壁，细胞膜，引起核酸结构损伤，抑制蛋白质及RNA的合成。IrnayuIiSitepu研究了45株酵母菌的耐受咲喃甲醛度，结果表明大部分菌株只能生长在〇-〇.5gL的呋喃甲醛的培养基中，仅有少部分菌株可以生长在IgL的呋喃甲醛中。高浓度的呋喃甲醛抑制了微生物的生长，菌株BREC-11可以高浓度耐受呋喃甲醛，这可以为生物炼制提供微生物资源及耐受基因资源。[0046]2.4菌株BREC-Il纤维素酶[0047]菌株BREC-Il在添加3.5gL的呋喃甲醛的改良的赫奇逊培养基中，30°C，150rmp条件下培养2d，测定纤维素酶活，测定滤纸酶活达到0.lUml，CMC酶活达到0.21Uml，纤维二糖酶活达到〇.〇7Uml。结果如图6所示。[0048]3.结论[0049]纤维素生物炼制的预处理过程中，存在一些具有毒性作用的抑制物质（呋喃甲醛及酚类抑制物等），会对微生物造成毒害作用，从而造成了发酵效率的下降。研究人员为了克服这一困境，筛选了大量的耐受菌株及相关的耐受基因，但是这些研究都是基于发酵菌株，如大肠杆菌，酿酒酵母，凝结芽孢杆菌，运动单胞菌等。本发明以呋喃甲醛为抑制物，通过纤维素降解培养基连续富集培养，分离到一株高耐受性的纤维素降解菌BREC-11，经过多相分类学的初步鉴定菌株BREC-Il是芽孢杆菌属的一个种。[0050]高浓度的呋喃甲醛抑制了纤维素的生物炼制，Peng在研究乳酸产生菌BacilluscoagulansP38过程中发现，BacilluscoagulansP38虽然耐受咲喃甲醛浓度达到IOgL—S但是在呋喃甲醛浓度达到6gIZ1时乳酸产量就受到了严重抑制。SarahJField研究了71株Saccharomycescerevisiae和Saccharomycesparadoxus·的咲喃甲酸的耐受浓度，仅有五株菌在3gI1的呋喃甲醛中生长，乙醇产量产量下降，本发明筛选的BacillusBREC-Il可以耐受3.5gL—1咲喃甲醛，在3.5gL—1咲喃甲醛浓度下，滤纸酶活达到0.lUml，CMC酶活达到0.21Uml，纤维二糖酶活达到0.07Uml。可以在秸杆预处理过程中发挥作用，为生物炼制的预处理过程提供菌株资源。[0051]以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

权利要求：1.一株暹罗芽孢杆菌BacillussiamensisBERC-Il，保藏于广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号:GDMCCNo.60223。2.含有权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌BERC-11的发酵液或培养液。3.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌BERC-Il或权利要求2所述的发酵液或培养液在木质纤维素物质的预处理上的应用。4.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌BERC-Il或权利要求2所述的发酵液或培养液在微生物肥料制备中的应用。

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