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申请/专利权人：中国水产科学研究院黄海水产研究所

摘要：本发明属于细胞遗传学与分子生物学技术领域，涉及海洋水母螅状体的整体原位杂交的检测方法。包括以下步骤：将螅状体依次用多聚甲醛梯度海水溶液进行固定，再用乙醇溶液对固定样品脱水，将脱水的螅状体进行水化、固定、乙酰化处理；将处理后的样品进行预杂交、杂交；将杂交后的样品进行封闭和荧光显色检测。本发明首次提供了海洋水母螅状体的RNA整体原位杂交步骤，水母螅状体个体完整，触角分散展开，水母螅状体着色清晰、杂交信号特异性强、杂交背景低。本发明建立的实用、稳定的海洋水母螅状体RNA整体原位杂交技术，有利于对其进行基因表达模式的分析。

主权项：1.一种海洋水母螅状体的整体原位杂交的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、螅状体的固定：将螅状体依次用多聚甲醛梯度海水溶液进行固定，溶液中梯度海水体积浓度由高向低，再用乙醇溶液对固定样品脱水，获得脱水的螅状体；B、螅状体的整体原位杂交：将脱水的螅状体进行水化、固定、乙酰化处理；将处理后的样品进行预杂交、杂交；对杂交后的样品封闭处理和荧光显色检测。

全文数据：海洋水母螅状体的整体原位杂交的检测方法技术领域本发明属于细胞遗传学与分子生物学技术领域，涉及检测海洋水母螅状体目的基因的整体原位杂交方法。背景技术整体原位杂交是运用cRNA或寡核苷酸等探针检测完整组织中mRNA表达的一种技术。该技术方法可以在保留组织甚至器官结构基本完整的基础上，从整体上直观地反映目的基因在组织器官发育中的时空表达情况和表达的发育图式，并可用于分析目的基因在相应组织或器官形成中的作用。目前，对生物组织甚至个体的整体原位杂交研究取得了很多突破，建立了斑马鱼、涡虫等模式动物的原位杂交方法樊竑冶等，斑马鱼整体原位杂交的技术改良，激光生物学报，2010,191:115-119；王秀丽等，涡虫整体原位杂交方法的优化改良，济南大学学报自然科学版，2012,262:147-151。并且中国专利CN102021227A公开了一种对合浦珠母贝目的基因的全胚定位方法，实现了对海洋生物的整体原位杂交。但是，目前的整体原位杂交技术无法应用于水母组织的观察，难点集中在两个方面。其一也是最大的难点是水母组织中含水量超过95％，远超其他水生生物，细胞中大量的水分子导致细胞内多肽和无机离子难以在遭受剧烈的外部刺激时，有效地维持渗透压的稳定，因而对处理过程中保持水母组织样品的完整性造成了很大困难。其二是水母螅状体结构精细，触手的形状、分布、数目随种而异。由于螅状体发育阶段存在多种不同形态，且细微结构复杂，如果固定不好，会造成触手固缩聚集，甚至出现不同程度的脱离现象。上述由于水母的生理结构的特殊性造成的整体原位杂交检测困难，使得采用传统方法获得的杂交结果，背景信号高、探针特异性弱、着色不清晰。目前还没有一种针对海洋水母螅状体样品的整体原位杂交方法，本专利为研究海洋水母螅状体有关基因的功能研究提供准确、有效的技术支持。发明内容本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供了一种海洋水母螅状体的整体原位杂交的检测方法。本发明提供的用于检测海洋水母螅状体目的基因的整体原位杂交方法，包括如下步骤：A、螅状体的固定：将螅状体依次用多聚甲醛梯度海水溶液进行固定，溶液中梯度海水体积浓度由高向低，再用乙醇溶液对固定样品脱水，获得脱水的螅状体；B、螅状体的整体原位杂交：将脱水的螅状体进行水化、固定、乙酰化处理；将处理后的样品进行预杂交、杂交；将杂交后的样品进行封闭和荧光显色检测。上述多聚甲醛梯度海水溶液，多聚甲醛终浓度为0.04gmL，溶剂为由海水和磷酸缓冲液组成的浓度梯度混合液，溶剂中海水体积浓度依次由100％减少到0％。上述螅状体的固定包括以下步骤：A1、螅状体的采集后，用海水冲洗螅状体后，除去海水；A2、螅状体的固定，0.04gmL多聚甲醛梯度海水溶液依次冲洗螅状体，溶剂中海水体积浓度分别为100％、80％、60％、40％、20％、0％；最后在0.04gmL多聚甲醛磷酸缓冲溶液中，于4℃固定8-12h；A3、除去固定的螅状体中的溶液，依次用梯度乙醇溶液脱水，每次平放10-15min，最后保存在-20℃的乙醇中，获得脱水的螅状体。上述螅状体的整体原位杂交包括以下步骤：B1、将固定脱水的螅状体水化、蛋白消化；B2、将消化后的螅状体进行再次固定，之后进行乙酰化；B3、将乙酰化的样品进行预杂交和杂交；B4、消化残留未反应的RNA探针；B5、螅状体的抗体孵育、荧光显色。上述水化处理之后进行蛋白消化；终止蛋白消化反应利用混合液漂洗，再用甘氨酸溶液漂洗；所述混合液为100gmL甘氨酸水溶液、10mgmL蛋白酶K消化液按体积比1:50混合；所述甘氨酸溶液为NaPBS-Tween溶液稀释100gmL甘氨酸水溶液至2mgmL。将消化后的螅状体进行再次固定，利用0.04gmL多聚甲醛溶液固定1h；所述0.04gmL多聚甲醛溶液溶质为多聚甲醛，溶剂为1MNaOH、90mgmLNaPBS和1MHCl按体积比1:8:1的混合溶液。乙酰化处理为0.1M三乙醇胺溶液浸泡样品，除去溶液后用0.1M三乙醇胺溶液漂洗，最后用乙酸酐和三乙醇胺混合液浸泡静置。本发明公开的的整体原位杂交方法，用于检测目的基因为Frizzled1基因，为GenbankAccessionNo.KJ719304所示的DNA。本发明提供的技术方案中所用探针如SEQIDNO:1所示序列组成。海蜇Rhopilemaesculentum是我国近海常见的一种胶质动物，隶属刺胞动物门Cnidaria，钵水母纲Scyphozoa，根口水母目Rhizostomeae，根口水母科Rhizostomatidae，海蜇属。海蜇栖息于近海水域，螅状体附着生活，成体浮游生活，在中国沿海各海域均有分布。本发明提供的整体原位杂交方法可用于检测海蜇水母螅状体。本发明取得的有益效果是：本发明的技术方案中采用优化的水螅体固定方法，不但简化了操作步骤，可以现场完成水母螅状体的采集，减少人为误差，提高了该固定方法的灵活性和可操作性，拓展了实用范围，而且。并且该固定方法对抗原的破坏小，且水母螅状体个体完整，触手分散展开，各层细胞颗粒清楚，细胞排列致密整齐。适用于后期免疫荧光染色。本发明首次提供了海洋水母螅状体的RNA整体原位杂交步骤，使水母螅状体着色清晰、杂交信号特异性强、杂交背景低。本发明建立的实用、稳定的海洋水母螅状体RNA整体原位杂交技术，有利于对其进行基因表达模式的分析。附图说明图1-图4分别是实施例1、对比例1、2、3获得的海蜇螅状体固定样品体视显微镜成像结果图。图5-图8分别是实施例2、对比例4、5、6获得的海蜇螅状体固定样品体视显微镜的荧光显色结果图。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，均采用分析纯试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所采用溶液均为灭菌、失活降解酶的去离子水配置。本发明样本成像观测利用奥林巴斯OlympusSZX10体视显微镜，成像倍数60倍。地高辛标记DNA和检测试剂盒，购自Roche公司，货号11585614910，配备：碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体、杂交液、封闭液、NBTBCIP检测等试剂。蛋白酶K购自生工生物工程上海股份有限公司，货号A510453；核糖核酸酶ARNaseA购自生工生物工程上海股份有限公司，货号B500474；核糖核酸酶T1RNaseT1购自生工生物工程上海股份有限公司，货号BF0025。20×SSC购自invitrogen，货号15557-044。下列实施例中所用部分试剂配方如下：NaPBSpH7.4：4.5gNaCl、50mLPBS0.2M,pH7.4，水定容至500mL；NaPBS-Tween：100μLTween-200.1％vv溶于100mLNaPBSpH7.4；消化液：1μL蛋白酶K10μgmL溶于1mLNaPBS-Tween；RNase消化液：4μLRNaseA10mgmL、0.2μLRNaseT1100,000UmL溶于2mL洗脱液3；TMN：1mLTris1M,pH9.6、500μLMgCl21M、200μLNaCl5M，水定容至10mL；TMNT：1mLTris1M,pH9.6、500μLMgCl21M、200μLNaCl5M、Tween-201mg，水定容至10mL；NBT：15mg四唑氮蓝、140μL二甲基甲酰胺溶于60μL水；BCIP：10mg5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐溶于200μL二甲基甲酰胺；显色缓冲液：1.2mg左旋咪唑溶于2.5mLTMN；显色液：5μLNBT75mgmL、7μLBCIP50mgmL溶于2mL显色缓冲液；洗脱液1：2.5mL20×SSC、5mL去离子甲酰胺、0.5mL10％SDS和5μLTween-20，水定容至10mL；洗脱液2：1mL20×SSC、5mL去离子甲酰胺、0.4mL10％SDS和5μLTween-20，水定容至10mL；洗脱液3：3mL20×SSC和30μLTween-20，水定容至30mL；洗脱液4：0.1mL20×SSC和10μLTween-20，水定容至10mL；洗脱液1-4依据地高辛标记DNA和检测试剂盒说明书配置。水为经DEPC处理消灭RNA酶的三次蒸馏水，20×SSC为pH7.4的柠檬酸钠缓冲液。一、水母螅状体的固定实施例1步骤A1、水母螅状体的采集取水母螅状体波纹板，将一片波纹板放入过滤海水中，刮下螅状体进行观察，将同一发育阶段的螅状体吸入同一离心管中。先用过滤海水冲洗一遍螅状体，再用灭菌海水冲洗一遍，吸去多余的灭菌海水。将离心管内的螅状体分次吸入无RNA酶的收集管中，贴标签日期、时间、发育阶段。对装有水母螅状体的收集管进行快速离心，吸去多余灭菌海水。步骤A2、水母螅状体的固定参照表1配制混合液，获得澄清溶液。表1.混合液配制表灭菌海水PBS0.1M,pH7.4混合液1定容至100mL混合液280mL定容至100mL混合液360mL定容至100mL混合液440mL定容至100mL混合液520mL定容至100mL混合液6定容至100mL将4g多聚甲醛分别溶于100mL混合液1-6中配制成固定液1-6。向一个步骤1中获得的装有水母螅状体的收集管中，依次分别用100μL固定液1-6重悬螅状体，每次静置10min，每次静置完毕后吸去上层固定液，最后保存在固定液6中，4℃冷藏，固定8-12h，得到水母螅状体初步固定样品。拍照固定，成像结果图如图1所示。步骤A3、水母螅状体的脱水将装有水母螅状体固定样品的收集管快速离心，吸去上层固定液。依次用乙醇水溶液体积浓度50％、75％、90％脱水，每次平放10-15min，最后保存在-20℃的100％乙醇中。对比例1将4g多聚甲醛分别溶于100mLPBS0.1M,pH7.4磷酸缓冲液中配制成固定液7。采用实施例1的操作步骤，采集水母螅状体，并利用固定液7对步骤A获得水母螅状体进行固定，进行拍照，观察固定效果，成像结果图如图2所示。最后对固定样品进行乙醇脱水。对比例2参照表2配制混合液，获得澄清溶液。表2.混合液配制表将4g多聚甲醛分别溶于100mL混合液7-11中配制成固定液7-11。采用实施例1的操作步骤，采集水母螅状体，依次用固定液7-11对步骤A获得水母螅状体进行固定，进行拍照，观察固定效果，成像结果图如图3所示。最后对固定样品进行乙醇脱水。对比例3参照表3配制混合液，在60-65℃条件下助溶，获得澄清溶液。表3.混合液配制表MOPS0.5M，Ph7.5NaCl5M灭菌海水PBS0.1M,pH7.4混合液1220mL10mL定容至100mL混合液1320mL10mL80mL定容至100mL混合液1420mL10mL60mL定容至100mL混合液1520mL10mL40mL定容至100mL混合液1620mL10mL20mL定容至100mL混合液1720mL10mL定容至100mL注：MOPS水溶液用浓NaOH调至pH为7.5，滤去杂质。将4g多聚甲醛分别溶于100mL混合液12-17中配制成固定液12-17。采用实施例1的操作步骤，采集水母螅状体，依次用固定液12-17对步骤A获得水母螅状体进行固定，最后对固定样品进行乙醇脱水。对固定样品进行拍照，成像结果图如图4所示。实施例1采用的固定液能够很好的保持水母螅状体个体完整，触手分散展开，有利于后续的原位杂交实验。对比例1、对比例2的固定方法导致水母螅状体整体蜷缩，无法进行后期水母样品的种类鉴别、组织构成、蛋白表达等研究实验。对比例2虽然采用了梯度海水稀释的固定液，但是触手整体蜷缩情况仍无任何改善迹象。对比例3固定效果较好，螅状体样本的触手可以展开。为保持水母样品组织、个体的细胞、组织液渗透压平衡，加入MOPS缓冲液和NaCl溶液，严格控制采集、固定过程中样品所在溶液的pH值和离子浓度，导致操作过程繁琐，对精细化要求高。二、水母螅状体的整体原位杂交实施例2步骤B1：水母螅状体的水化、消化按照上述实施例1中所述方法，获得固定脱水处理的水母螅状体，将螅状体转移进四孔细胞培养板中，进行水化，依次通过70％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、30％乙醇的NaPBS-Tween溶液各漂洗10min，最后用NaPBS-Tween漂洗三次，每次6min。每孔中加入消化液在25℃静置消化8min。终止消化，向每孔中加入终止液100mgmL甘氨酸水溶液、上述消化液体积比1：50，快速吸去；再用甘氨酸溶液2mgmL，NaPBS-Tween稀释100gmL甘氨酸水溶液漂洗5min；最后用NaPBS-Tween漂洗两次，5min次。步骤B2：水母螅状体的固定、乙酰化将水母螅状体用0.04gmL多聚甲醛溶液多聚甲醛溶于NaOH1M：NaPBS：HCl1M体积比为1:8:1的混合溶液固定1h，再用NaPBS-Tween漂洗两次，5min次。每孔中加入三乙醇胺溶液0.1M,pH8.0浸没螅状体，静置1min，更换三乙醇胺溶液漂洗5min；最后更换混合液20μL乙酸酐溶于5mL三乙醇胺水溶液静置10min。步骤B3：水母螅状体的预杂交、杂交螅状体用NaPBS-Tween漂洗两次，5min次；在杂交液中于42℃恒温水浴15min；然后加入杂交液于60℃摇动，预杂交3h。将探针溶于杂交液中，终浓度为200ngmL将螅状体在杂交液中于60℃摇动，杂交10h。终止杂交，吸去含有探针的杂交液，加入杂交液于60℃摇动15min；分别加入洗脱液进行漂洗，洗脱顺序：洗脱液1中于60℃漂洗两次，20min次；洗脱液2中于60℃漂洗5min，降温至37℃漂洗10min；洗脱液2中于37℃漂洗两次，15min次；洗脱液3中于37℃漂洗两次，5min次。步骤B4：RNase消化每孔中加入RNA酶消化液于37℃静置20-22min；终止消化，吸去RNA酶消化液，分别接入洗脱液进行漂洗，洗脱顺序：洗脱液3中于37℃漂洗三次，5min次；洗脱液中于60℃漂洗两次，20min次；洗脱液4中于60℃漂洗20min；最后用NaPBS-Tween漂洗5min。步骤B5：螅状体的抗体孵育、荧光显色对螅状体进行室温封闭1h；将抗体封闭液以1：2000比例于4℃孵育螅状体过夜；螅状体用NaPBS-Tween于4℃漂洗四次，20min次；再用TMNT于4℃漂洗三次，10min次；再用TMN于4℃漂洗5min。随后加入NBTBCIP显色液避光显色。终止显色，用NaPBS-Tween漂洗两次，5min次；用4％多聚甲醛于室温固定1h，用NaPBS-Tween漂洗两次，5min次。将螅状体于体积浓度80％甘油的NaPBS溶液中保存，直接观察荧光显色效果，显色结果如图5所示。由图5的成像结果可以看出，通过整体原位杂交检测，Frizzled1基因在螅状体触手细胞中高表达，而在其他部位的细胞中难以检测到高含量的Frizzled1转录RNA。图5可以清楚的展现海洋水母螅状体样本的Frizzsled1基因表达的时空分布状况。对比例4按照上述实施例2的操作步骤，步骤B1中终止蛋白酶消化，吸去消化液之后，向每孔中加入甘氨酸溶液2mgmL，NaPBS-Tween稀释100gmL甘氨酸水溶液漂洗5min加入向每孔中加入NaPBS-Tween漂洗两次，5min次。观察显色效果，荧光显色结果如图6所示。对比例4中蛋白酶K消化效果差，破坏细胞结构，导致螅状体触手细胞无法保持原有形态。对比例5采用上述实施例2的操作步骤，步骤B2中0.04gmL多聚甲醛溶液为多聚甲醛溶于90mgmLNaPBS溶液中。观察显色效果，荧光显色结果如图7所示。图7展现的螅状体样本荧光信号明显降低，难以清楚地反应Frizzsled1基因在整体中的表达情况。0.04gmL多聚甲醛溶液能较好地保持组织及细胞内的RNA，同时对形态保持也较好，但是对比例5中使用的0.04gmL多聚甲醛溶液导致螅状体细胞内生物大分子过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。对比例6采用上述实施例2的操作步骤，步骤B2中利用多聚甲醛固定之后，每孔中加入三乙醇胺溶液0.1M,pH8.0浸没螅状体，静置1min，最后更换0.4vv％乙酸酐溶液静置10min。观察显色效果，荧光显色结果如图8所示。在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐和三乙醇胺中以减低静电效应，可以减少探针对组织的非特异性背景染色。但是对比例6中采用三乙醇胺溶液和乙酸酐溶液，乙酰化效果差，探针结合整个螅状体样本，无法特异性检测Frizzsled1基因的RNA分布。当然，上述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定对本发明的实施例范围。本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围内。序列表110中国水产科学研究院黄海水产研究所120海洋水母螅状体的整体原位杂交的检测方法130FST2018-11-141601170SIPOSequenceListing1.02101211888212DNA213海蜇Rhopilemaesculentum4001atttggtgggttattcttactttgacctggtttttggcggcaggaatgaaatggagccat60gaagctattgaaggaaactcgcagtacttccacgcagcggcctgggcactccctgccgct120aaaaccatcgcgattctggccatgcatgaagttgatggagatgagctcagtggtatctgt180tttgttggtggttcaaacttgcaagcattgcgaggattcttgctagcccctctgttcgtt240taccttgtccttggcacgttttttcttctcgctggtttcatctcgttggtccgcatacgg300tcagttcttaagcacgatcagtcgctgaaaaccgacaaacttacacgtctgatgatccgc360attggtgtcttctcaatcctgtacacgttgccagccattattgtgattgcatgcttgttt420tatgaacaggcctaccgccacacctgggacagtgcatggatcagatcttggtatagaaca480aaaatattttgcaacgacatgcaagtagataaaaagtactgttctagtcagatcattgga540gttgagaggccagactttgctgtatacatgataaagttcctgatgatgttgatggtaggg600attacctctggtttttggatctggtctggcaaaacactcacatcctggaaaaggttttac660tatgtgagaatactcaaaagatcaatgccaaagaaccctcactcacatggacatggtgct720tcatccaggacaaacgtgtgaagttaacctcaccagaaacaaacaaggcctacttgtaac780tcttgttctgacacatgtattgcagttgacagtacatcagaacaaatcaaatgagttgcc840cagttggggattgtgtgctgtaccttttgaaagttgtcacagtgccag888

权利要求：1.一种海洋水母螅状体的整体原位杂交的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、螅状体的固定：将螅状体依次用多聚甲醛梯度海水溶液进行固定，溶液中梯度海水体积浓度由高向低，再用乙醇溶液对固定样品脱水，获得脱水的螅状体；B、螅状体的整体原位杂交：将脱水的螅状体进行水化、固定、乙酰化处理；将处理后的样品进行预杂交、杂交；对杂交后的样品封闭处理和荧光显色检测。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述多聚甲醛梯度海水溶液，多聚甲醛终浓度为0.04gmL，溶剂为由海水和磷酸缓冲液组成的浓度梯度混合液，溶剂中海水体积浓度依次由100％减少到0％。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述螅状体的固定包括以下步骤：A1、螅状体的采集后，用海水冲洗螅状体后，除去海水；A2、螅状体的固定，0.04gmL多聚甲醛梯度海水溶液依次冲洗螅状体，溶剂中海水体积浓度分别为100％、80％、60％、40％、20％、0％；最后在0.04gmL多聚甲醛磷酸缓冲溶液中，于4℃固定8-12h；A3、除去固定的螅状体中的溶液，依次用梯度乙醇溶液脱水，每次平放10-15min，最后保存在-20℃的乙醇中，获得脱水的螅状体。4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述螅状体的整体原位杂交包括以下步骤：B1、将固定脱水的螅状体水化、蛋白消化；B2、将消化后的螅状体进行再次固定，之后进行乙酰化；B3、将乙酰化的样品进行预杂交和杂交；B4、消化残留未反应的RNA探针；B5、螅状体的抗体孵育、荧光显色。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述水化处理之后进行蛋白消化；终止蛋白消化反应利用混合液漂洗，再用甘氨酸溶液漂洗；所述混合液为100mgmL甘氨酸水溶液、10mgmL蛋白酶K消化液按体积比1:50混合；所述甘氨酸溶液为NaPBS-Tween溶液稀释100gmL甘氨酸水溶液至2mgmL。6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，将消化后的螅状体进行再次固定，利用0.04gmL多聚甲醛溶液固定1h；所述0.04gmL多聚甲醛溶液溶质为多聚甲醛，溶剂为1MNaOH、90mgmLNaPBS和1MHCl按体积比1:8:1的混合溶液。7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述乙酰化处理为0.1M三乙醇胺溶液浸泡样品，静置1-3min，除去溶液后用0.1M三乙醇胺溶液漂洗两次；最后用乙酸酐和三乙醇胺混合液浸泡静置10min。8.根据权利要求5-7任一项所述的检测方法，其特征在于，用于检测目的基因为Frizzled1基因，为GenbankAccessionNo.KJ719304所示的DNA。9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所用探针为SEQIDNO:1所示序列组成。10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，用于检测海蜇水母螅状体目的基因的表达。

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